沈華超， 李文磊， 黃素素， 朱 金， 徐德友， 沈麗華， 丁新生

缺血性腦血管病以其高發(fā)病率和高致殘率成為當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類健康的一大類重要疾病，但有效的治療方法非常有限。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)具有自我更新能力，能夠分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞移植可以直接或間接替代已經(jīng)壞死的神經(jīng)細(xì)胞或組織，重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，部分恢復(fù)已喪失的功能，被認(rèn)為是最有潛力的治療腦缺血的方法［1］。然而干細(xì)胞移植治療最大的難題是移植的神經(jīng)干細(xì)胞存活、軸突生長及和正常組織建立突觸連接困難。PTEN(phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten)是近年來新發(fā)現(xiàn)的同時具有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，負(fù)性調(diào)節(jié)mTOR通路。研究發(fā)現(xiàn)PTEN/mTOR信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，是神經(jīng)發(fā)生和再生的一個重要的內(nèi)在控制分子［2～5］。本研究通過體外分離培養(yǎng)大鼠海馬NSCs，觀察其誘導(dǎo)分化過程中PTEN和反映mTOR蛋白活性的P-S6R的表達(dá)變化，以期了解PTEN/mTOR信號通路在神經(jīng)干細(xì)胞分化成熟中的作用，探究神經(jīng)干細(xì)胞分化成熟至一定階段后生長及再生能力下降的原因，為促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康新生1d的Sprague-Dawley(SD)乳大鼠，體重3～5g(南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，常規(guī)條件飼養(yǎng))。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(Gibco);ACCUTASE(Gibco);青鏈霉素(Hyclone);胎牛血清(FBS)(Hyclone);B27(Gibco);堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF(Peprotech);表皮細(xì)胞生長因子EGF(Peprotech);兔抗大鼠PTEN多克隆抗體(cell signaling technology);兔抗大鼠P-S6R多克隆抗體(cell signaling technology);兔抗大鼠Nestin多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology);FITC標(biāo)記羊抗兔IgG二抗、R標(biāo)記驢抗兔IgG二抗(Santa Cruz Biotechnology)。CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)，熒光倒置相差顯微鏡(尼康儀器有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.3 大鼠NSCs的分離培養(yǎng) 取新生1d SD乳大鼠，于無菌條件下分離出大腦半球，剔除腦膜，分離出海馬，立即置入預(yù)冷的DMEM/F12中，將海馬機械剪碎后用槍頭吹打至單細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，棄上清，沉淀物用完全培養(yǎng)基重懸(含有20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF，2%B27，1% 雙抗的DMEM/F12)，200目的篩網(wǎng)過濾，血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)后，以5×105cells/ml的濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h后換液一次，以后每隔3～4d換液一次。待原代培養(yǎng)的神經(jīng)球直徑達(dá)到200μm左右(大約6～7d)時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收集神經(jīng)球，1000r/min離心5min，棄培養(yǎng)基，加入1ml ACCUTASE，37℃消化5min，用槍頭機械吹打神經(jīng)球為單個細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105cells/ml，接種到25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。大約6～7d傳代一次，取第3代細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.4 實驗分組及NSCs的誘導(dǎo)分化 收集第三代NSCs，以1000r/min離心5min，棄上清，用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(含有1%FBS和2%B27的DMEM/F12培養(yǎng)基)重懸細(xì)胞，用機械吹打的方法將神經(jīng)球分散成單個細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后以5×105cells/ml的濃度接種到PDL包被的培養(yǎng)皿中，隨機分為0d組、1d組、3d組和7d組，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別誘導(dǎo)分化1d、3d和7d。0d組不做誘導(dǎo)分化處理，直接用于實驗

1.5 免疫熒光檢測 取第3代NSCs接種在內(nèi)置玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，取出玻片，用PBS沖洗3次，每次5min;4%的多聚甲醛室溫原位固定15min，細(xì)胞面朝上，PBS洗 3 次，每次 5min;0.3%Triton作用10min，PBS洗3次，每次5min;胎牛血清37℃封閉1h后加入Nestin一抗(1∶200)，放入濕盒內(nèi)4℃過夜，同時用PBS代替一抗作陰性對照。棄一抗，PBS洗3次，避光環(huán)境下加入熒光二抗(1∶200)，37℃孵育1h。PBS洗3次，封片，然后立即在熒光顯微鏡下觀察，攝片。取誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)干細(xì)胞，分別用PTEN和P-S6R一抗(稀釋度1∶200和1∶100)檢測PTEN和P-S6R蛋白的表達(dá)，具體步驟同上。

1.6 Western blotting檢測 收集各組細(xì)胞，加裂解液，冰上裂解30min，4℃超聲破碎，12000r/min離心15min，取上清測定蛋白濃度，-80℃保存待用。調(diào)整樣品蛋白濃度一致后以等體積上樣，行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，濃縮膠和分離膠分別以恒壓100V、150V均電泳lh，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜上，用含5%脫脂奶粉封閉1h后，加入PTEN(1∶1000)和P-S6R(1∶2000)一抗，4℃搖床過夜，用TBST緩沖液漂洗10min×3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫?fù)u床孵育1h，TBST緩沖液漂洗10min×3次，采用化學(xué)發(fā)光法在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)曝光顯色，以β-actin作為內(nèi)參，用待檢測蛋白與β-actin灰度值的比值進(jìn)行比較。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCs的培養(yǎng)、觀察及鑒定 原代培養(yǎng)的NSCs:剛分離出來的細(xì)胞呈圓形，折光性較強，培養(yǎng)2d后可見到單細(xì)胞出現(xiàn)分離增殖現(xiàn)象，形成大量的4～5個細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，6～7d后可見增殖形成的神經(jīng)球，大小不一，直徑約200μm左右。收集NSCs機械吹散成單細(xì)胞，置于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，可觀察到懸浮的單個細(xì)胞分裂、聚集，呈圓球形，大小不一，具有較強的折光性，培養(yǎng)5d后，培養(yǎng)液中可見單細(xì)胞增殖再次形成神經(jīng)球，細(xì)胞形態(tài)不變。原代和傳代培養(yǎng)的神經(jīng)球接種到6孔培養(yǎng)板內(nèi)涂有PDL的蓋玻片上繼續(xù)培養(yǎng)4h后進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測，經(jīng)神經(jīng)干細(xì)胞特征性標(biāo)記神經(jīng)巢蛋白(Nestin)染色均為陽性(見圖1)。

2.2 NSCs誘導(dǎo)分化過程中神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)變化 NSCs接種到培養(yǎng)皿中，未誘導(dǎo)分化時呈球狀懸浮生長，大小不一;誘導(dǎo)分化1d時可見大量神經(jīng)樣細(xì)胞，胞體呈梭性或橢圓形，并伸出突起;隨著NSCs誘導(dǎo)分化時間的延長，神經(jīng)樣細(xì)胞漸趨成熟。誘導(dǎo)分化至7d時神經(jīng)樣細(xì)胞胞體體積增大，細(xì)胞形態(tài)各異，NSCs初步分化成熟(見圖2)。

2.3 NSCs誘導(dǎo)分化后PTEN和P-S6R的細(xì)胞免疫熒光染色 NSCs誘導(dǎo)分化后細(xì)胞免疫熒光顯示:PTEN和P-S6R的細(xì)胞免疫熒光染色均呈陽性。PTEN在胞漿和胞核中均有表達(dá)，而P-S6R主要表達(dá)在胞漿中(見圖3)。

2.4 NSCs分化成熟過程中PTEN蛋白的表達(dá)變化 在NSCs誘導(dǎo)分化過程中，PTEN的表達(dá)隨著分化時間的延長有明顯的增高。與分化0d組相比，3d組和7d組PTEN表達(dá)明顯增高(均P﹤0.01);與1d組相比，3d組和7d組PTEN表達(dá)亦明顯增高(P﹤0.01和P﹤0.05);與0d組相比，1d組雖有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與3d組相比，7d組雖有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。以上結(jié)果表明，隨著 NSCs的逐漸分化成熟，PTEN的表達(dá)呈明顯增加的趨勢，分化3d時其表達(dá)明顯增加，到7d時，仍然高水平表達(dá)。隨著NSCs的誘導(dǎo)分化時間的延長，P-S6R的表達(dá)呈下降趨勢。與誘導(dǎo)分化0d組相比，3d組和7d組P-S6R表達(dá)均明顯下降(均P﹤0.01);與分化1d組相比，3d組和7d組 P-S6R表達(dá)亦明顯下降(均 P﹤0.01);與0d組相比，1d組雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與3d組相比，7d組雖有增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。以上表明隨著NSCs的逐漸分化成熟，P-S6R的表達(dá)呈明顯下降的趨勢，分化至3d時，P-S6R明顯降低，當(dāng)分化至7d時，表達(dá)水平仍然較低。

圖1 免疫熒光染色鑒定NSCs(400×)

圖2 NSCs誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)特征(200×)

圖3 NSCs誘導(dǎo)分化后PTEN和P-S6R細(xì)胞熒光染色(200×)

3 討論

NSCs是一類具有高度自我更新能力并能分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)前體細(xì)胞，廣泛分布于發(fā)育和成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，研究證實這類細(xì)胞可以在體外分離培養(yǎng)并長期傳代克隆，原代和傳代培養(yǎng)的NSCs在適宜的條件下具有多向分化的潛能，這就為缺血性腦血管病提供了一種潛在的治療方法，即外源性NSCs的移植治療。然而腦缺血后移植的NSCs分化成熟至一定階段后軸突內(nèi)在生長能力和再生能力下降，使得腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)有限。PTEN作為一種腫瘤抑制基因被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)也較為廣泛，Perandones等［6］在鼠的大腦皮質(zhì)、小腦、海馬及嗅球等部位的神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)均有PTEN表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)NSCs誘導(dǎo)分化后PTEN和P-S6R細(xì)胞免疫熒光染色為陽性，證實了NSCs分化成熟過程中PTEN和P-S6R均有表達(dá)，其中PTEN在胞漿和胞核中均有表達(dá)，而P-S6R主要表達(dá)在胞漿中。PTEN主要通過其脂質(zhì)磷酸酶活性作用于下游PI3K的下游靶分子PIP3，從而使PIP3脫磷酸化生成PIP2阻斷AKT 及其下游激酶的活性［7，8］。PI3K/Akt/mTOR信號通路是參與細(xì)胞增殖﹑分化﹑凋亡和代謝的重要信號通路，mTOR是PI3K/Akt信號通路下游的一個效應(yīng)分子，mTOR激活后，可激活下游靶蛋白PS6R。P-S6R活化后促進(jìn)核糖體蛋白和翻譯調(diào)節(jié)蛋白的合成，從而對蛋白合成進(jìn)行調(diào)節(jié)。已經(jīng)證實，Akt/mTOR/P-S6R通路可通過調(diào)節(jié)cap-依賴性蛋白翻譯的起始來調(diào)控蛋白質(zhì)合成，控制細(xì)胞的生長和大小，支持細(xì)胞的生長和存活［9］。因此，PTEN可通過負(fù)性調(diào)節(jié)P-S6R的活性，抑制相關(guān)蛋白的生成和細(xì)胞的生長，從而限制細(xì)胞和組織的過度增殖。本研究顯示，與分化0d和1d相比，NSCs分化至第3天時，PTEN表達(dá)明顯增高(均P﹤0.01)，而P-S6R明顯下降(均P﹤0.01);分化至第7天時，PTEN的表達(dá)仍然較高(P﹤0.01和P﹤0.05)，P-S6R表達(dá)較低(均P﹤0.01)。這說明NSCs分化成熟過程中PTEN表達(dá)逐漸增高，而P-S6R的表達(dá)逐漸下降。據(jù)此，我們推測在 NSCs分化成熟過程中PTEN/mTOR信號通路很可能是通過PTEN抑制mTOR的活性，下調(diào)了P-S6R的表達(dá)，從而參與抑制NSCs分化成熟后細(xì)胞增殖和軸突的生長能力。類似的研究發(fā)現(xiàn)PTEN在未分化的神經(jīng)元和PC12細(xì)胞中表達(dá)很低，而在用神經(jīng)營養(yǎng)素誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)上調(diào)［10］。

PTEN在體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟過程中也有相似的改變。Lachyankar等［11］研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在小鼠腦發(fā)育晚期約在出生0d開始表達(dá)，成年時達(dá)高峰。在神經(jīng)元的發(fā)育過程中，樹突中的PTEN的表達(dá)進(jìn)行性增加，成年時到達(dá)高峰，從而下調(diào)蛋白合成，限制樹突的生長和突觸的可塑性。這些研究結(jié)果提示在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟過程中PI3K/Akt/mTOR一方面促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖分化成熟;另一方面又通過上調(diào)PTEN抑制PI3K/AKT/mTOR通路，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞及其軸突的過度分化生長，動態(tài)地調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的平衡，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能。然而成熟神經(jīng)系統(tǒng)PTEN的高表達(dá)抑制了神經(jīng)細(xì)胞及其軸突的生長能力，不利于腦卒中后缺血灶周圍神經(jīng)的再生修復(fù)，從而影響患者的功能恢復(fù)。已有研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因敲除的成年小鼠，室管膜下區(qū)的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞具有明顯增強的持續(xù)增殖能力及向神經(jīng)元分化的能力［12，13］。

總之，本研究提示PTEN/mTOR信號通路是調(diào)控NSCs增殖分化成熟的重要分子機制，PTEN/mTOR的時空表達(dá)變化控制著NSCs的增殖分化和軸突生長能力。NSCs分化成熟過程中PTEN表達(dá)增高可能是導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞分化成熟至一定階段后增殖分化能力和軸突生長、再生能力下降、不能建立有效的突觸聯(lián)系的重要原因。本研究結(jié)果為提高神經(jīng)干細(xì)胞移植治療的效率提供了新思路，對探索腦缺血的有效治療途徑有重要意義。進(jìn)一步的研究可在體外進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞PTEN抑制實驗，以觀察NSCs的增殖分化能力和軸突生長、再生能力，再進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦缺血，以期能夠更明顯地促進(jìn)腦缺血后的功能恢復(fù)。

［1］Miljan EA，Sinden JD.Stem cell treatment of ischemic brain injury［J］.Curr Opin Mol Ther，2009，11(4):394-403.

［2］Park KK，Liu K，Hu Y，et al.Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway［J］.Science，2008，322(5903):963-966.

［3］Liu K，Lu Y，Lee，J K，et al.PTEN deletion enhances the regenerative ability of adult corticospinal neurons［J］.Nat Neurosci，2010，13(9):1075-1081.

［4］Park KK，Liu K，Hu Y，et al.PTEN/mTOR and axon regeneration［J］.Exp Neurol，2010，223(1):45-50.

［5］Christie KJ，Webber CA，Martinez JA，et al.PTEN inhibition to facilitate intrinsic regenerative outgrowth of adult peripheral axons［J］.J Neurosci，2010，30(27):9306-9315.

［6］Perandones C，Costanzo RV，Kowaljow V，et al.Correlation between synaptogenesis and the PTEN phosphatase expression in dendrites during postnatal brain development［J］.Brain Res Mol Brain Res，2004，128(1):8-19.

［7］Gary DS，Mattson MP.PTEN regulates Akt kinase activity in hippocampal neurons and increases their sensitivity to glutamate and apoptosis［J］.Neuromolecular Med，2002，2(3):261-269.

［8］Yamada KM，Araki M.Tumor suppressor PTEN:modulator of cell signaling，growth，migration and apoptosis［J］.J Cell Sci，2001，114(13):2375-2382.

［9］Memmott RM，Dennis PA.Akt-dependent and-independent mechanisms of mTOR regulation in cancer［J］.Cell Signal，2009，21(5):656-664.

［10］Musatov S，Roberts J，Brooks AI，et al.Inhibition of neuronal phenotype by PTEN in PC12 cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101(10):3627-3631.

［11］Lachyankar MB，Sultana N，Schonhoff CM，et al.A role for nuclear PTEN in neuronal differentiation［J］.J Neurosci，2000，20(4):1404-1413.

［12］Gregorian C，Nakashima J，Le Belle J，et al.Pten deletion in adult neural stem/progenitor cells enhances constitutive neurogenesis［J］.J Neurosci，2009，29(6):1874-1886.

［13］Groszer M，Erickson R，Scripture-Adams DD，et al.PTEN negatively regulates neural stem cell self-renewal by modulating G0-G1 cell cycle entry［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(1):111-116.