孫倩，馬守棟，李明春（1.青島大學(xué)藥學(xué)系，山東青島66071；.解放軍401醫(yī)院，山東青島66000）

納米銀粒子由20～15 000個(gè)銀原子按照一定順序排列組成，具有獨(dú)特的理化特性和生物特性。其作為一種新型高效無機(jī)抗菌材料[1]，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，表現(xiàn)出良好的抗菌殺菌作用。但銀作為重金屬中的一種，如過量吸收會(huì)對(duì)肝臟等組織器官產(chǎn)生毒副作用。因此，有必要建立快速準(zhǔn)確測(cè)定生物樣品中銀含量的方法。目前，測(cè)定銀含量的方法主要有電化學(xué)方法[2]、紫外分光光度法[3]、原子吸收法[4-8]、催化動(dòng)力學(xué)光度法[9]，其中最常用的方法為原子吸收法。這些方法有些操作簡(jiǎn)單但靈敏度不高，有些靈敏度高但對(duì)樣品處理要求較高，且測(cè)定的樣品多為土壤、水質(zhì)和礦物質(zhì)，而測(cè)定生物樣品中銀含量的研究較少。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）靈敏度高、速度快、譜線簡(jiǎn)單、干擾相對(duì)于光譜技術(shù)少、動(dòng)態(tài)線性范圍寬，具有很低的檢測(cè)限，測(cè)定RSD可到0.1%。筆者采用ICP-MS測(cè)定納米銀乳膏[10]在燒傷模型大鼠血漿及組織中的銀分布，對(duì)預(yù)測(cè)納米銀的毒性有積極作用，為納米銀早日成藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

702型超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）；AE240型電子分析天平（美國(guó)Mettler公司）；Elan DRCⅡ型ICP-MS（美國(guó)Perkin Elmer公司）。

1.2 藥品與試劑

磺胺嘧啶銀乳膏（江門市恒健藥業(yè)有限公司，批號(hào)：091003，規(guī)格：每支40 g）；乳膏基質(zhì)、納米銀乳膏（規(guī)格：20 μg/g）均由解放軍第401醫(yī)院藥廠藥研室自制；銀標(biāo)準(zhǔn)溶液（中國(guó)海洋研究所，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：GBW08610，規(guī)格：1 000 μg/ml）。

1.3 動(dòng)物

成年SD大鼠24只，♀♂各半，由青島藥物研究所中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2011-0007。實(shí)驗(yàn)前7 d使大鼠熟悉實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，自由攝食飲水。

2 方法

2.1 工作條件設(shè)置

儀器操作條件及主要測(cè)定參數(shù)如下：射頻功率為1 250 W，脈沖電壓為1 200 V，霧化氣流速為0.80 L/min，等離子氣流速為15 L/min。數(shù)據(jù)采集模式采用跳峰模式。

2.2 建模

實(shí)驗(yàn)前24 h用8%硫化鈉脫去大鼠后背及臀部毛，面積約5 cm×5 cm，用乙醚麻醉，取仰臥位將大鼠脫毛處置于帶側(cè)枝的圓底燒瓶口上（內(nèi)徑25 mm，瓶口溫度98℃），蒸氣熏蒸9 s，造成5%體表總面積深Ⅱ度蒸氣燒傷模型[11]。

2.3 分組與給藥

將模型大鼠隨機(jī)分為納米銀乳膏組、磺胺嘧啶銀乳膏組、基質(zhì)對(duì)照組，每組8只，分別于受傷感染處涂藥0.1～0.2 cm厚，每日1次，連續(xù)30 d。大鼠單籠飼養(yǎng)，并用膠帶將頸部固定，防止舔舐藥物，第30天時(shí)大鼠創(chuàng)面愈合完全。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將銀標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)1%HNO3逐步稀釋制備成0.01、0.50、1.00、5.00、10.00 μg/ml的銀標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在“2.1”項(xiàng)儀器參數(shù)條件下，以銀標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，測(cè)得分析峰的響應(yīng)值（y）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為y＝0.312 7x+0.001 3（r＝0.999 9），結(jié)果表明銀檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.01～10.00 μg/ml。

2.5 檢測(cè)限考察

以1%HNO3作為銀標(biāo)準(zhǔn)的空白溶液，對(duì)其重復(fù)測(cè)定10次，得到3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)的濃度值，即為本方法的檢測(cè)限。結(jié)果檢測(cè)限為0.980 ng/ml，說明ICP-MS測(cè)定銀含量的靈敏度較高，可以滿足生物樣品中銀含量的測(cè)定要求。

2.6 精密度考察

取1.00、5.00、10.00 μg/ml的銀標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照“2.1”項(xiàng)儀器參數(shù)條件設(shè)置，測(cè)定其中的銀含量，重復(fù)測(cè)定8次。結(jié)果，1.00、5.00、10.00 μg/ml的銀標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中銀的質(zhì)量濃度分別為（1.21±0.02）、（5.03±0.13）、（10.07±0.21）μg/ml，RSD分別為1.65%、2.58%、2.09%（n＝8），說明方法精密度良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取基質(zhì)對(duì)照組大鼠的肝臟樣本20份，每份約0.2 g，5份為一組，分為空白組和低、中、高水平（0.1、1.0、10.0 μg/ml）組，精密稱定后置于高效防腐消解罐中，分別加入對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的銀標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.25 ml，再加入2 ml的MOS級(jí)（高純）硝酸密閉，移入150℃烘箱中加熱12 h后轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，定容，搖勻，用ICP-MS測(cè)定組織和器官中的銀含量。按公式：（測(cè)得值－空白組測(cè)得值）×0.2/（加入量×0.25）×100%計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝8）Tab 1Result of recovery test（ ±s，n＝8）

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝8）Tab 1Result of recovery test（ ±s，n＝8）

組別空白組低水平組中水平組高水平組加入量，μg/ml 0 0.1 1.0 10.0測(cè)得值，μg/g 0.029 0.146 1.436 13.505加樣回收率，%RSD，%93.2±3.3 112.5±1.0 107.8±1.3 3.5 0.9 1.2

2.8 銀含量測(cè)定

將創(chuàng)面愈合完全的各組大鼠停藥24 h后處死，取血，解剖，稱取心、肝、脾、腎組織各0.2 g，置于高效防腐消解罐中，加入2 ml的MOS級(jí)硝酸密閉，移入150℃烘箱中加熱12 h后轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，定容，搖勻。按照“2.1”項(xiàng)下設(shè)置的儀器參數(shù)，測(cè)定各組大鼠血漿和心、肝、脾、腎組織中的銀含量。結(jié)果表明，與基質(zhì)對(duì)照組比較，磺胺嘧啶銀乳膏組大鼠血漿和心、肝、脾、腎組織中的銀含量均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），而納米銀乳膏組大鼠僅脾組織中銀含量明顯增加（P＜0.05）。表明納米銀在保證療效的同時(shí)也減少了銀在血漿和組織中的蓄積。各組大鼠血漿和組織中痕量銀分布情況見表2。

3 討論

納米銀粒徑小、表面積大，物理、化學(xué)和生物活性均較高，帶來了正面效應(yīng)，也存在負(fù)面效應(yīng)。納米銀能夠通過呼吸道、消化道、暴露皮膚及其他途徑進(jìn)入體內(nèi)，并很有可能在多個(gè)組織器官中分布蓄積，從而造成病理?yè)p害。因此有必要研究納米銀在體內(nèi)的分布和蓄積情況，以此了解納米銀在體內(nèi)遷移、分布和蓄積的生物學(xué)特性。這就首先需要建立一種快速準(zhǔn)確地測(cè)定生物樣品中銀含量的方法。

表2 各組大鼠血漿和組織中痕量銀分布情況（±s，n＝8）Tab2 Distribution of trace silver in plasma and tissues of rats（±s，n＝8）

表2 各組大鼠血漿和組織中痕量銀分布情況（±s，n＝8）Tab2 Distribution of trace silver in plasma and tissues of rats（±s，n＝8）

與基質(zhì)對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.base control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

血漿，μg/ml 0.231 3±0.015 2 1.471 3±0.215 7＊0.135 7±0.092 5組別納米銀乳膏組磺胺嘧啶銀乳膏組基質(zhì)對(duì)照組心臟，μg/g 0.211 7±0.070 1 1.378 6±0.238 3＊0.125 7±0.014 6脾臟，μg/g 0.412 6±0.089 1＊2.097 6±0.196 9＊＊0.146 2±0.015 3肝臟，μg/g 0.231 5±0.031 2 1.567 2±0.135 8＊0.127 9±0.015 8腎臟，μg/g 0.298 6±0.037 1 1.769 1±0.172 1＊0.156 2±0.017 1

相對(duì)于傳統(tǒng)的電化學(xué)方法、紫外分光光度法、原子吸收法、催化動(dòng)力學(xué)光度法等檢測(cè)痕量銀的方法，本研究采用ICP-MS，檢測(cè)限為0.980 ng/ml，加樣回收率為（93.2±3.3）%～（112.5±1.0）%。表明用ICP-MS測(cè)定銀含量具有極低的檢測(cè)限和較寬的線性范圍，加樣回收率較高，是一種痕量元素的強(qiáng)有力的分析技術(shù)。進(jìn)一步用該方法測(cè)定組織和血漿中的銀含量，結(jié)果表明納米銀作為一種新型抗菌材料，較磺胺嘧啶銀可以有效地減少銀的蓄積，因此納米銀較磺胺嘧啶銀有較低的毒性。但其進(jìn)入體內(nèi)的方式以及對(duì)各組織器官中細(xì)胞的影響還需進(jìn)一步深入研究，探討其產(chǎn)生毒性的機(jī)制，從而使納米銀更好、更安全地服務(wù)于臨床。

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