陳炳鈿 周文藝 吳 焜 連建蕓 李泳寧*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013；2.福建新閩科生物科技開發(fā)有限公司 福州 350008）

近年來，隨著飼料工業(yè)的不斷發(fā)展，對蛋白飼料的需求量越來越大，同時(shí)由于捕撈過度等原因，造成魚粉產(chǎn)量減少，使得可用作動(dòng)物生產(chǎn)的蛋白質(zhì)資源十分缺乏，供給的短缺使魚粉價(jià)格居高不下，價(jià)格不斷上漲。蛋白資源的缺乏，嚴(yán)重制約了我國飼料工業(yè)的發(fā)展，為了減少對魚粉的依賴程度，具有高消化率的優(yōu)質(zhì)蛋白成為首選的替代品，而發(fā)酵豆粕就是其中一種。發(fā)酵豆粕具有較高的蛋白溶解度和較小的分子量，部分已達(dá)到小肽和氨基酸水平，有助于動(dòng)物的消化吸收；同時(shí)發(fā)酵豆粕具有一定的芳香氣味，適口性較好，且消除了豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，減少了對動(dòng)物生長產(chǎn)生不同程度的抑制作用［1］。因此，優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵豆粕已經(jīng)開始部分取代魚粉，并在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮越來越重要的作用［2-4］。

豆粕的粗蛋白質(zhì)含量較高，可達(dá)40%以上，且含多種氨基酸對畜禽攝入營養(yǎng)很有好處。但豆粕分子量較大，動(dòng)物難以消化吸收，而且豆粕中含有抗?fàn)I養(yǎng)因子，對動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能產(chǎn)生了不良的影響，采用酶解或微生物發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行處理可以破壞其抗?fàn)I養(yǎng)因子，分解大分子蛋白為小分子多肽，可有效提高蛋白質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的消化率［5-6］。

目前微生物發(fā)酵技術(shù)常采用曲霉、芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌等其中的一種或幾種的混合發(fā)酵工藝［7-9］，雖然能去除其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，但混合發(fā)酵工藝控制難度大，豆粕蛋白的水解程度較低；同時(shí)多數(shù)發(fā)酵豆粕常用三氯乙酸可溶性氮來表征多肽含量，而未對其多肽的分子量進(jìn)行表征。本試驗(yàn)研究了一種新的復(fù)合微生物固態(tài)發(fā)酵工藝，根據(jù)所選菌株的生長代謝特性采用了先好氧后厭氧的固態(tài)分階段發(fā)酵工藝，并進(jìn)行了條件優(yōu)化，最終得到含有活性益生菌、乳酸和小分子肽的生物活性飼料，產(chǎn)品發(fā)酵豆粕中88.94%的多肽分子量小于2 300 Da，而且其中大部分達(dá)到小肽和氨基酸的水平，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 地衣芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、釀酒酵母本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 原料與試劑 豆粕購于福海糧油公司，豆粕粉碎并過80 目篩；玉米和麩皮均購于市場；其他試劑均為分析純。

1.2 種子培養(yǎng)基配方

地衣芽孢桿菌液體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10、蛋白胨5、硫酸鎂1.5、磷酸二氫鉀1.5，水1 000 mL，pH7.0。

釀酒酵母液體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30、蛋白胨5、氯化鉀0.5、磷酸二氫鉀1.0、硫酸鎂0.5、硫酸鋅0.1、硫酸鐵0.1，水1 000 mL，pH7.0。

嗜酸乳桿菌液體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨10、牛肉膏10、酵母膏5、磷酸二氫鉀2、醋酸鈉5、檸檬酸銨2、硫酸鎂0.2、硫酸錳0.2、吐溫80 1.0，水1 000 mL，pH6.2。

1.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的基質(zhì)成分及配比（%）：豆粕95、麩皮4、硫酸銨0.1、磷酸氫二鉀0.1、硫酸鎂0.1、氯化鈉0.2、葡萄糖0.5。

1.4 發(fā)酵工藝 試管斜面→三角瓶→5 L 發(fā)酵罐→接種至固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)→固態(tài)淺盤發(fā)酵→檢測。好氧發(fā)酵階段采用通過管道直接向恒溫潔凈室內(nèi)通入無菌空氣，厭氧發(fā)酵階段則關(guān)閉通氣，恒溫發(fā)酵。

1.5 檢測項(xiàng)目 菌體量測定：液體菌數(shù)采用顯微鏡血球板計(jì)數(shù)法，發(fā)酵豆粕則采用平板法計(jì)數(shù)。蛋白含量：采用凱氏定氮法，參照GB/T 6432-1994 飼料中粗蛋白測定方法。乳酸含量測定采用山東省科學(xué)院生物研究所生物傳感分析儀（SBA-40E）進(jìn)行測定。多肽含量測定采用三氯乙酸可溶性氮（TCA-NSI）法，參照文獻(xiàn)［9］測定方法。多肽分子量測定采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合微生物菌劑配比對豆粕發(fā)酵的影響 將地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌液體發(fā)酵后的菌種按下述比例混勻后，按10%接種量添加到已滅菌固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)上，并補(bǔ)入一定量無菌水至含水量為50%，采用淺盤好氧發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后產(chǎn)物取樣進(jìn)行分析檢測，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)合微生物菌劑配比對固態(tài)發(fā)酵的影響

由表1 可以看出，三種菌株不同配比下發(fā)酵豆粕中的粗蛋白含量沒有顯著差異。當(dāng)配比中地衣芽孢桿菌的含量較高時(shí)（2：1：1）×109，發(fā)酵后產(chǎn)物中多肽含量和總菌數(shù)均最高，這主要是由于地衣芽孢桿菌具有較快的生長速率和較高的產(chǎn)酶能力，在接種至固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)后，快速生長且產(chǎn)生大量胞外酶能有效降解豆粕，多肽含量最高達(dá)16.27%。而當(dāng)酵母菌和嗜酸乳桿菌含量較高時(shí)，會(huì)影響地衣芽孢桿菌的生長代謝，對蛋白的分解效果不佳，但代謝產(chǎn)乳酸的能力較強(qiáng)，乳酸含量較高，分別達(dá)到2.50%和2.89%。因此，綜合考慮各種指標(biāo)，當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌的配比在（2：1：1）×109時(shí)可獲得較好的協(xié)同生長代謝的作用，發(fā)酵產(chǎn)物的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到較優(yōu)的水平，本試驗(yàn)選擇（2：1：1）×109作為后續(xù)試驗(yàn)的配比組成進(jìn)行研究。

2.2 復(fù)合微生物接種量對豆粕發(fā)酵的影響 將上述優(yōu)化配比后的菌種復(fù)配后，按5%、10%、15%、20%的接種量接入固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，采用淺盤好氧發(fā)酵工藝法進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后產(chǎn)物取樣進(jìn)行分析檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 復(fù)合微生物接種量對豆粕發(fā)酵的影響

從圖1 可以看出，當(dāng)接種量從0～10%時(shí)，隨著接種量的增大，發(fā)酵后產(chǎn)物中的多肽含量顯著增加，當(dāng)接種量達(dá)到10%時(shí)，多肽含量達(dá)到15.78%，再增大接種量時(shí)，產(chǎn)物中的多肽含量增加并不明顯。而從粗蛋白含量來看，在不同接種量條件下進(jìn)行發(fā)酵，隨著接種量的增大，發(fā)酵后產(chǎn)物中的粗蛋白含量也隨之增加，但差別并不顯著，在接種量為20%時(shí)的粗蛋白含量最高，達(dá)到52.86%。此外，在接種量高時(shí)由于菌數(shù)量較高大，胞外酶活較高，隨著小分子蛋白的進(jìn)一步降解，產(chǎn)生了脫氨的現(xiàn)象，發(fā)酵后產(chǎn)品酸味較重，氣味刺鼻、脫氨嚴(yán)重。因此，綜合考慮發(fā)酵效果及成本，采用10%接種量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 含水量對豆粕發(fā)酵的影響 將復(fù)合微生物菌劑按10%接種量接種至固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)上，分別補(bǔ)入一定的無菌水，控制含水量為40%、45%、50%、55%和60%，采用淺盤好氧發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后產(chǎn)物取樣進(jìn)行分析檢測，結(jié)果見圖2。

圖2 含水量對豆粕發(fā)酵的影響

從圖2 可以看出，當(dāng)含水量為40%時(shí)對豆粕降解的降解效果較差，發(fā)酵豆粕中多肽含量較低，僅有14.36%。增加含水量到45%時(shí)多肽含量的增加顯著，45%含水量下的多肽含量達(dá)到17.21%，再增大含水量多肽含量略有下降，但當(dāng)含水量達(dá)到60%時(shí)，多肽含量則顯著下降，僅達(dá)到14.52%。不同含水量對固態(tài)發(fā)酵過程中總菌數(shù)也有顯著影響，當(dāng)含水量為45%時(shí)，微生物總菌數(shù)僅1.26×109，隨著含水量的增加，微生物總菌數(shù)顯著增加，當(dāng)含水量為50%時(shí)，微生物總菌數(shù)最高達(dá)到2.06×109，通過鏡檢觀察，產(chǎn)物中地衣芽孢桿菌菌體生長旺盛。再增加含水量，總菌數(shù)略有下降，主要是由于含水量較高時(shí)不利于固態(tài)發(fā)酵中好氧發(fā)酵過程的通氣，導(dǎo)致地衣芽孢桿菌的生長代謝受到影響，但其發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌和嗜酸乳桿菌數(shù)明顯增加，細(xì)胞的生長和代謝活性較強(qiáng)，pH 值顯著下降。從發(fā)酵產(chǎn)物的形態(tài)看45%水分發(fā)酵產(chǎn)品亮黃色、質(zhì)地干散，易于干燥；而60%含水量時(shí)為金黃色、芳香味、質(zhì)地良好，產(chǎn)物結(jié)塊嚴(yán)重，不易于干燥。因此，綜合考慮發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量和干燥成本，選擇45%含水量進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

2.4 好氧厭氧發(fā)酵階段對固態(tài)發(fā)酵的影響 在上述優(yōu)化條件下，根據(jù)微生物菌種特性進(jìn)一步分階段進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，采用了好氧厭氧分階段發(fā)酵法，考察在不同菌種發(fā)酵特性下對固態(tài)發(fā)酵的影響，結(jié)果見表2。

表2 好氧厭氧發(fā)酵階段對固態(tài)發(fā)酵的影響

從表2 可以看出，培養(yǎng)過程中好氧和厭氧發(fā)酵階段的時(shí)間變化對粗蛋白含量并無顯著差異。但隨著好氧培養(yǎng)時(shí)間的增加，明顯有利于改善接種后菌體的生長，好氧培養(yǎng)24 h、48 h和72 h的發(fā)酵產(chǎn)物中總菌數(shù)均達(dá)到20 億以上，其中通過鏡檢觀察，多數(shù)為地衣芽孢桿菌，可見，在前期增加好氧時(shí)間，有利于地衣芽孢桿菌的生長。而在純厭氧條件下有利于嗜酸乳桿菌的生長，因此，其最終產(chǎn)物中的乳酸含量較高，達(dá)到2.87%，pH 值也降到4.61 左右。從多肽含量來看，好氧階段在48 h 以上時(shí)可獲得較好的降解效果，多肽含量均達(dá)到17%以上，其中48 h的多肽含量最高，達(dá)19.22%。而純好氧培養(yǎng)條件下有利于地衣芽孢桿菌的生長，但地衣芽孢桿菌過量生長，大量地分泌胞外酶，隨著固態(tài)發(fā)酵的進(jìn)行，最終形成脫氨，導(dǎo)致總氮含量下降，發(fā)酵產(chǎn)物的氨味重，無酒香味，適口性變差。因此，在固態(tài)發(fā)酵中增加一定的厭氧發(fā)酵時(shí)間有利于酵母菌和嗜酸乳桿菌的生長，其代謝產(chǎn)生乙醇和乳酸等代謝產(chǎn)物使得發(fā)酵產(chǎn)物芳香味濃，酸味強(qiáng)，增加了產(chǎn)物的適口性。

綜合三種益生菌株在固態(tài)發(fā)酵過程所起的作用和作用階段的特點(diǎn)，采用好氧48 h、厭氧24 h的固態(tài)發(fā)酵工藝可獲得較好的發(fā)酵效果。2.5 發(fā)酵豆粕中多肽的分子量分布 將發(fā)酵豆粕中可溶性多肽進(jìn)行液相色譜分析，采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測定多肽的相對分子量。以蛋清白蛋白（43 000 Da）、牛血清白蛋白（67 000 Da）和匙孔貝血藍(lán)蛋白（350 000 Da）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析，牛血清白蛋白和發(fā)酵豆粕中多肽的液相色譜圖見圖3-圖4。

圖3 牛血清白蛋白液相色譜圖

圖4 發(fā)酵豆粕中多肽液相色譜圖

以三種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量對數(shù)和出峰時(shí)間作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得方程y=-1.1701x+24.939（R2=0.997）。從發(fā)酵豆粕中多肽的液相色譜圖中可以看出，其出峰時(shí)間均大于20 min，且大部分蛋白出峰時(shí)間均在21 min 后。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程計(jì)算，20.022 min 出峰蛋白的分子量約為16 000 Da，約占多肽蛋白含量的11.06%。而其他大部分蛋白出峰時(shí)間均在21 min之后，其相對分子量約為2 300 Da，占88.94%，多數(shù)在22 min 后出峰，其相對蛋白分子量約為320 Da。可見發(fā)酵豆粕中88.94%的多肽分子量小于2 300 Da，而且其中大部分達(dá)到小肽和氨基酸的水平，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白產(chǎn)品。

3 結(jié)論

試驗(yàn)分別采用液體發(fā)酵制備地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌的菌種，將3 種微生物菌株按一定的比例接種于豆粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，優(yōu)化的發(fā)酵工藝條件為，地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌的配比在為（2：1：1）×109，接種量為10%，含水量為45%。采用好氧48 h、厭氧24 h的固態(tài)發(fā)酵工藝，發(fā)酵產(chǎn)物中總菌數(shù)可達(dá)2.18×109cfu/g，，乳酸含量達(dá)2.51%，多肽含量達(dá)到19.22%，其中88.94%的多肽分子量小于2 300 Da，而且其中大部分達(dá)到小肽和氨基酸的水平。

由此可見，根據(jù)三種益生菌株在固態(tài)發(fā)酵過程所起的作用和作用階段的特點(diǎn)，采用好氧48 h、厭氧24 h的固態(tài)發(fā)酵工藝可獲得較好的發(fā)酵效果，明前期好氧階段有利于地衣芽孢桿菌的生長代謝，產(chǎn)生大量的酶類和其他生物活性物質(zhì)，后期轉(zhuǎn)為厭氧后，釀酒酵母和嗜酸乳桿菌成主導(dǎo)作用菌群，進(jìn)一步生長代謝和降解固態(tài)基質(zhì)，并產(chǎn)生乙醇和乳酸等生物活性物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物多肽含量高，且多數(shù)達(dá)到小肽和氨基酸水平，同時(shí)含有大量的活性微生物和乳酸等生物活性物質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)的微生物酵解活性肽產(chǎn)品。

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