洪志勇 李玉芳，2 張興峰 林秀嬌 李鴻翔 莊益芬 張文昌*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 福州 350002；2.黃淮學(xué)院 河南駐馬店 463000）

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)成分，約占血漿總蛋白的60%。在體內(nèi)人血清白蛋白主要起著維持滲透壓、保證液體在血管中流動(dòng)、遞送重要生化物質(zhì)以及作為高容量?jī)?chǔ)庫(kù)穩(wěn)定體內(nèi)游離配基的濃度。由于它在輸血、補(bǔ)液、治療發(fā)燒、外傷休克、抗利尿水腫等臨床應(yīng)用上的顯著療效，HSA 在國(guó)內(nèi)外都有很大的市場(chǎng)需求。據(jù)近年報(bào)道，目前HSA 全球年銷售量高達(dá)600 t左右，按目前50 美元／10g 計(jì)，每年銷售額在30 億美元以上。HSA 在全球的需求量呈上升態(tài)勢(shì)，近年來(lái)我國(guó)白蛋白需求量每年以49.2%的速度上升。然而市售HSA 主要從捐血者血漿或人胎盤中提取。但近年來(lái)越來(lái)越多的人因輸入血制品HSA 而感染了艾滋病、肝炎等傳染性疾病。血源病毒污染，加之國(guó)家對(duì)血制品嚴(yán)格控制進(jìn)口，致使HSA 供應(yīng)十分緊張，人們迫切期望開(kāi)發(fā)新的來(lái)源。為緩解這些矛盾，通過(guò)基因工程技術(shù)把人血清白蛋白基因克隆到微生物、動(dòng)物生物反應(yīng)器上進(jìn)行高效表達(dá)是最具有前景的方法。HSA 基因全長(zhǎng)16 916 bp，由14個(gè)內(nèi)含子和15個(gè)外顯子構(gòu)成，定位于人4 號(hào)染色體的q11-22 區(qū)段。目前已在小鼠［1］、乳牛［2］、豬［3］、綿羊等［4-5］系統(tǒng)中表達(dá)了重組HSA。

目前，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)重要的人類藥物蛋白的優(yōu)越性和可行性幾乎已達(dá)成共識(shí)。因此，通過(guò)制備禽類輸卵管生物反應(yīng)器生產(chǎn)HSA 將會(huì)呈現(xiàn)美好的前景。但是目前要制備禽類輸卵管生物反應(yīng)器高水平表達(dá)外源基因，還存在很多困難和問(wèn)題，嚴(yán)重制約了禽類輸卵管生物反應(yīng)器的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。因此，構(gòu)建一個(gè)高效真核表達(dá)載體，然后采用一定基因?qū)敕椒?，?lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并使外源基因能在禽類輸卵管組織中特異性表達(dá)就顯得十分重要。

卵清蛋白是蛋清中含量最高的蛋白，它的5’調(diào)控成分具有組織特異性，并受到激素的誘導(dǎo)，具有很強(qiáng)的表達(dá)活性。試驗(yàn)以流產(chǎn)胎兒肝臟組織為材料提取總RNA，用上游引物ALBF 與下游引物ALBR 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得編碼HSA的基因，并對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定與分析。再利用鵪鶉卵清蛋白5’調(diào)控區(qū)構(gòu)建HSA 基因能在鵪鶉輸卵管乳腺中特異性表達(dá)的質(zhì)粒載體，以期為下一步的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和將來(lái)通過(guò)體細(xì)胞核移植法制備禽類輸卵管生物反應(yīng)器打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 流產(chǎn)胎兒肝臟組織。

1.2 菌種和質(zhì)粒 宿主菌DH5a為本室保存；質(zhì)粒Pov（含有鵪鶉卵清蛋白5’調(diào)控區(qū)序列）由本實(shí)驗(yàn)室提供；載體pIRES2-EGFP 購(gòu)自Promega 公司；質(zhì)粒pGEM-T Easy Vector 購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.3 試劑

人血清蛋白基因克?。核靡镉缮虾Ｉ锕び邢薰竞铣?；DNAMarker、TRIzol 試劑、DEPC 水均購(gòu)自百泰克公司；RT-PCR 試劑盒ThermoscrioptTM、凝膠回收試劑盒為上海生物工程有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒（Omiga）、限制性內(nèi)切酶XhoI、T4 連接酶均購(gòu)自Promega 公司；2×Pfu PCR MasterMix為北京天為時(shí)代科技有限公司產(chǎn)品。

人血清白蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建：T4DNA 連接酶購(gòu)自Promega 公司；各種限制性內(nèi)切酶、Long Taq 酶、dNTP、DNAMarker 均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；凝膠回收試劑盒為上海生物工程有限公司產(chǎn)品，質(zhì)粒抽提試劑盒（Omiga）購(gòu)自Promega 公司。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 人血清白蛋白基因的克隆 從GenBank 中查到ALB的cDNA 序列NM_000477，借助計(jì)算機(jī)引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)了2條引物。引物序列如下（Xho I 酶切位點(diǎn)）。

上游引物：5’-CCGCTCGAG ATGAAGTGGGT AACCTTTATTTC-3’；

下游引物：5’-CCGCTCGAG TTATAAGCCTAA GGCAGCTTGAC-3’。

保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+加同源區(qū)，用Trizol 法提取樣品總RNA，進(jìn)行RT-PCR。以人源肝臟cDNA 文庫(kù)為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

取10μL 以上PCR 產(chǎn)物，加入1μL dNTP，2μL PCR buffer 及1μL 普通PCR Taq 酶，再加適量的水至終體積為20μL。72 ℃反應(yīng)10 min，使PCR 產(chǎn)物加A 尾。取7μL 反應(yīng)產(chǎn)物，pGEM-T 載體、T4 DNA 連接酶、10×buffer 各1μL，連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中。涂布于LA 平板，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h，挑選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并酶切鑒定。

酶切鑒定呈陽(yáng)性的菌落均送英駿公司測(cè)序，以測(cè)序結(jié)果來(lái)判斷ALB 在載體上的連接方向，選擇正確連接的質(zhì)粒進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.5 真核表達(dá)載體構(gòu)建為了保證能下一步與含有鵪鶉卵清蛋白5‘序列的質(zhì)粒載體順利融合，在引物SE5'端添加限制性內(nèi)切酶kpnⅠ酶切位點(diǎn)，AE5'端添加限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切位點(diǎn)，合成引物SE和AE：

SE：5′-CCGGGTACC ATGAAGTGGGTAACCTT TATTTC-3'；

AE：5′-CCGAAGCTTT TTATAAGCCTAAGGCA GCTTGAC-3'。

HESAcDNA 基因的PCR 擴(kuò)增，kpnⅠ/ HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pOV、pHSA，回收產(chǎn)物，用T4 連接酶定向連接并進(jìn)行酶切鑒定。酶切、回收、連接、鑒定均按說(shuō)明書進(jìn)行。

質(zhì)粒pOV-HSA和pIRES2-EGFP 空載體酶切處理，快速回收酶切產(chǎn)物，然后將兩者混合后加入T4 DNA 連接酶連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，涂布于LA 平板，培養(yǎng)12～16 h 后挑取單菌落陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。酶切、回收、連接、提取純化、鑒定均按說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 人肝臟組織總RNA 完整性和HSA 基因cDNA的RT-PCR 以人工流產(chǎn)胎兒肝臟組織為材料，提取總RNA，完整性較好，可以用于后續(xù)試驗(yàn)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。并以RT-PCR 方法擴(kuò)增出HSA 基因1 800 bp 左右的cDNA，全長(zhǎng)與預(yù)期大小一致，無(wú)干擾，表明是特異性擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 總RNA的甲醛變性電泳

圖2 PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.2 pGEM-T-ALB 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收RT-PCR 產(chǎn)物目的帶，將其與T 載體連接并轉(zhuǎn)化E.coli DH5 a，在含Amp 并預(yù)先涂布IPTGIX-Gal的LB 平板上篩選，挑取白斑提取質(zhì)粒。用kpnⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，切下了分別為約3.0 kb、1.8 kb 大小的條帶(圖3)，前者與載體大小相符，后者與HSA cDNA條帶的大小一致，結(jié)果與預(yù)期相符，這說(shuō)明HSA cDNA 已成功克隆到T 載體上，獲得了陽(yáng)性重組質(zhì)粒pTH。

圖3 重組質(zhì)粒酶切圖譜

2.3 HSA cDNA 測(cè)序 測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST 軟件分析，與Genbank 中報(bào)道的HSA 基因有97%的同源性。個(gè)別堿基缺失，但整個(gè)讀碼框并未改變，保證了最大的讀碼框。序列分析表明，已成功克隆HSA cDNA 序列，可以用于表達(dá)載體的構(gòu)建。見(jiàn)圖4。

圖4 改造的HSA cDNA 克隆序列的比較分析

2.4 人血清白蛋白基因的改造 以克隆有HAS cDNA的質(zhì)粒pHSA為模板，通過(guò)特異性引物的擴(kuò)增，在HAS cDNA的兩端添加了kpnⅠ和HandⅢ酶切位點(diǎn)，并與PGEM-T 載體連接后亞克隆，用雙酶切鑒定，約產(chǎn)生1 800 bp和3 000 bp的片斷，表明改造成功，結(jié)果見(jiàn)圖5。

2.5 HSA 初級(jí)表達(dá)載體pH-OV的構(gòu)建 利用kpnⅠ和HndⅢ酶切pOV和pHE 結(jié)果如下：將pHESA切為大小約1.8 kb和3.0 kb的兩段，其中小片段為HESA；將pOV 切為兩段，其中大片段含有鵪鶉卵清蛋白5'調(diào)控成分；并且將重組pH-OV 用kpnⅠ和HndⅢ雙酶切得到結(jié)果小片段HESA和含有鵪鶉卵清蛋白5'調(diào)控成分大片段，和預(yù)期結(jié)果一致，表明HSAcDNA和鵪鶉卵清蛋白5'調(diào)控成分成功的融合，得到HSA 初級(jí)表達(dá)載體pH-OV。見(jiàn)圖6。

圖6 初級(jí)表達(dá)載體PH-OV的構(gòu)建過(guò)程

2.6 人血清白蛋白真核表達(dá)構(gòu)建的結(jié)果 利用Xho I/kpnI 雙酶切重組質(zhì)粒PH-OV和載體IRES2-EGFP 結(jié)果如下：將重組質(zhì)粒PH-OV 切為大小兩段，其中大片段為僅含有目的基因HESA和鵪鶉卵清蛋白5'調(diào)控成分的片段；將IRES2-EGFP 切開(kāi)后，大片段為含有EGFP 報(bào)告基因和kan 抗性基因的片段。利用XhoI 單酶切pEGFP-VH 并以IRES2-pEGFP-VH 做PCR。酶切鑒定和PCR 鑒定后均表明，酶切后實(shí)現(xiàn)了定向連接，人血清白蛋白輸卵管表達(dá)基本構(gòu)件成功的定向克隆在真核表達(dá)載體IRES2-EGFP的多克隆位點(diǎn)區(qū)XhoI 之后，鵪鶉卵清蛋白5'調(diào)控成分驅(qū)動(dòng)的人血清白蛋白輸卵管特異性表達(dá)載體IRES2-pEGFP-VH 構(gòu)建成功，簡(jiǎn)命名為pEGFP-VH，見(jiàn)圖7。

圖7 重組質(zhì)粒pEGFP-VH 構(gòu)建結(jié)果

3 討論

在研究禽類輸卵管生物反應(yīng)器方面，主要研究禽類卵清蛋白調(diào)控區(qū)調(diào)控機(jī)制，通過(guò)卵清蛋白的調(diào)控成分，來(lái)啟動(dòng)外源基因特異的在輸卵管上皮細(xì)胞的高效分泌表達(dá)。Sanders等［6］和Park等［7］把不同長(zhǎng)度的卵清蛋白基5’因端調(diào)控區(qū)構(gòu)建在報(bào)告基因的上游，導(dǎo)入培養(yǎng)的原代輸卵管細(xì)胞，通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)情況，研究卵清蛋白基因5’端調(diào)控區(qū)的順式調(diào)控元件和反式作用因子等調(diào)控元件，并作出了卵清蛋白調(diào)控的大體模型。Haecker等［8］也用同樣的方法通過(guò)輸卵管細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因?qū)β亚宓鞍谆?’端調(diào)控區(qū)的各元件進(jìn)行了更詳細(xì)的研究，激素依賴性調(diào)控元件(SDRE)和反式調(diào)控因子(NRE)被定位且功能進(jìn)一步明確。在該研究基礎(chǔ)上，Ochiai等［9］把1.35 kb 長(zhǎng)的卵清蛋白基因5’調(diào)控區(qū)調(diào)控的人促紅細(xì)胞生成素(hEPO)基因通過(guò)電穿孔法導(dǎo)人原代輸卵管上皮細(xì)胞，探討了hEPO 基因轉(zhuǎn)錄的可能性；宇麗等［10］把1.1 kb的卵清蛋白5’端調(diào)控區(qū)調(diào)控的CAT基因通過(guò)脂質(zhì)體技術(shù)，轉(zhuǎn)染雞原代輸卵管上皮細(xì)胞和雞成纖維細(xì)胞。結(jié)果在雞原代輸卵管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后檢測(cè)到了外源基因。鄭新民等［11］采用顯微注射法，使含有豬血清白蛋白側(cè)翼序列的微小人血清白蛋白基因?qū)胴i的基因組中，生產(chǎn)出轉(zhuǎn)人血清白HSA 基因豬，經(jīng)PCR和Southern 雜交檢測(cè)，4 頭活仔整合有HSA 基因，其中3 頭不同程度表達(dá)了人血清白蛋白。在轉(zhuǎn)基因小鼠方面，曹新等［12］所構(gòu)建的pcDNA3.1-6.7hALBm 表達(dá)載體行尾靜脈注射直接轉(zhuǎn)染哺乳期母鼠的活體組織。通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)hALBm 基因在小鼠幾種組織中的表達(dá)來(lái)研究該構(gòu)建體的組織特異性。結(jié)果表明構(gòu)建體在受試鼠組織中的表達(dá)顯示了較好的乳腺組織特異性。以上說(shuō)明無(wú)論是輸卵管生物反應(yīng)器還是乳腺生物反應(yīng)器構(gòu)建具有較長(zhǎng)5’端上游乳蛋白調(diào)控區(qū)的輸卵管（乳腺）特異性表達(dá)載體對(duì)組織特異性表達(dá)是必需的。

本試驗(yàn)將HAS 目的基因與鵪鶉卵清蛋白5’調(diào)控區(qū)成功定向連接，為調(diào)控人血清白蛋白基因的分泌表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。就表達(dá)的載體總的結(jié)構(gòu)看，本實(shí)驗(yàn)采用真核表達(dá)載體IRES2-EGFP 進(jìn)行重組載體的構(gòu)建。IRES2-EGFP 載體自身帶有能發(fā)出綠色熒光的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因紫外線的激發(fā)下發(fā)出明亮的綠色熒光，其表達(dá)的綠色熒光蛋白可以在熒光顯微鏡下直接觀測(cè)，該蛋白還可與其他蛋白在N 及C 端融合表達(dá)，其表達(dá)均不受影響。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白是一種優(yōu)化的突變型綠色熒光蛋白，其產(chǎn)生的熒光較普通綠色熒光蛋白強(qiáng)35倍，大大增強(qiáng)了其報(bào)告基因的敏感度，無(wú)種系依賴性，熒光強(qiáng)度、靈敏度及穩(wěn)定性強(qiáng)，應(yīng)用廣泛。其序列中還含有CMV 強(qiáng)啟動(dòng)子和SV40 polyA 加尾信號(hào)，前者可增強(qiáng)外源基因的表達(dá)，后者可增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄效率。此外，該載體攜帶的新霉素抗性基因，提供了抗生素G418 篩選的標(biāo)志，便于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選。而且報(bào)告基因EGFP的存在使陽(yáng)性的篩選和純化變得快速、簡(jiǎn)便和直觀。在上游啟動(dòng)子5'端前有終止密碼子，很好地避免了報(bào)告基因和目的基因的融合表達(dá)，從而保證了將來(lái)表達(dá)和分泌的人血清白蛋白的生物活性不受影響。

［1］茍德明，鄭新民，陳乃清.人血清白蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的制備［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1996，16(6):570-575.

［2］黃淑幀，黃英，陳美壓，等.轉(zhuǎn)人血清白蛋白基因試管牛的研究［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2000，27(7):573-579.

［3］Miasanori S，Noboru M，Shintaro Y.A cDNA coding for human normal serum albumin and processfor production of the albumin［P］.Japan:EP 0330451，1989-08-30.

［4］Brash I，F(xiàn)aerman A，Baruch A，et al.Synthesis and secretion of human serum albumin by mammarygland exlants of virgin and lactating transgenic mice［J］.Transgenic Res，1993(2):266-276.

［5］Carter D C，He X M，Munson S H，et al.Three-dimensional structure of Human serum albumin［J］.Science，1989，244:1195-1198.

［6］Sanders M M，Mcknight G S.Positive and negative regulatory elements control the steroed-responsive ovalburnin promotor［J］.Biochemistry，1982，27:6550-6557.

［7］Park H M，Okumura J，Muramatsu T.Modulation of transcriptional activity of the chicken of albumin gene prornoter in primary cultures of chicken oviduct cells:effects of putative regulatory elements in the 5'-flanking region［J］.Biochem Mol Biol，1995.36(4):811-816.

［8］Haecker S A，Muramatsu T，Sensenbaugh K R，et al.Repression of the ovalbumin gene involves multiple negative elements including a ubiquitons transcriptional silencer［J］.Mol Endocrinol，1995，9(9):1113-1126.

［9］Ochiai H，Park H M，Nakamura A，et al.Synthesis of human erythropoietin in vivo in the oviduct of laying hens by localized in vivo gene transfer using electroporationl［J］.Poult Sci，1998，77:299-302.

［10］宇麗，趙君，張艷玲，等.雞卵清蛋白基因上游調(diào)控序列表達(dá)載體的構(gòu)建及其在雞原代輸卵管上皮細(xì)胞及雞成纖維細(xì)胞的表達(dá)［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，21(1):21-24.

［11］鄭新民，魏慶信，喬憲鳳，等.表達(dá)人血清白蛋白轉(zhuǎn)基因豬的研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，16(1):199-121.

［12］曹新，曾溢滔.山羊β-酪蛋白基因啟動(dòng)子指導(dǎo)人血清白蛋白基因在小鼠組織中的特異性表達(dá)［J］.遺傳，2001(6):518-520.