辛樹權(quán)，劉海音，沈 勇

（長春師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130032）

隨著工業(yè)的發(fā)展，石油在給人們帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，對環(huán)境造成了極大的威脅。由于油田采出液不僅含有石油，也含有高濃度的鹽分，因此，采油現(xiàn)場附近發(fā)生溢漏會(huì)使土壤受到油和鹽的雙重污染[1]。目前石油污染已成為全世界各國亟待解決的問題，研究人員都在積極尋找治理石油污染的有效途徑。利用物理或化學(xué)方法處理石油污染物可以得到較好的效果，但成本高及二次污染等問題使其應(yīng)用受到了限制。作為一種環(huán)境友好替代技術(shù)，石油污染土壤的生物修復(fù)已受到更多相關(guān)領(lǐng)域研究者的重視[2]。微生物修復(fù)以其高效、經(jīng)濟(jì)和無二次污染等諸多優(yōu)點(diǎn)而成為近些年來主要處理石油污染土壤的方法，但微生物修復(fù)仍然存在著一定的局限性，因此微生物修復(fù)技術(shù)還需更深入的研究[3-5]。

石油的主要組成部分是由碳?xì)浠衔镄纬傻臒N類，約占石油組分的95%～99%，其中烴類化合物有烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴，此外還有40多種微量的金屬元素，如鈉、鉀、鈣、鎂等，其中鈉約占75%[3-6]。本文的研究是關(guān)于以含有兩個(gè)苯環(huán)的多環(huán)芳烴萘為唯一碳源從被石油副產(chǎn)品污染的土壤中分離出的純菌株，在不同pH和不同鹽濃度下菌株的生長情況以及該菌對石油降解性能的研究，同時(shí)也為石油污染的微生物修復(fù)提供新的菌種資源和信息。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

長春二道區(qū)中國石油東環(huán)城路加油站附近被石油副產(chǎn)品污染的土壤。

1.1.2 主要試劑與儀器

萘（上海中國遠(yuǎn)航試劑廠），恒LD4-2離心機(jī)，T6新悅-可見分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 萘降解菌株的分離和培養(yǎng)

使用以萘為惟一碳源(200mg·L-1)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.02g，NH4NO31.00g，KH2PO40.40g，Na2HPO4·3H2O 0.60g，MnSO4·H2O 0.02g，CaCl·2H2O 0.02g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g[5]，加蒸餾水定容至 1000 ml，萘200mg/L，pH值7.0。

萘用正己烷溶解配制成200 mg·L-1的萘試劑加入到培養(yǎng)基中。

1.2.2 分離篩選培養(yǎng)基

無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基，無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入瓊脂20g。

1.3 土壤中萘降解菌株的分離

土壤用100目的篩子過濾，除去大的雜質(zhì)顆粒，然后取1 g土壤制備成土壤溶液，靜止后取稀釋液0.1ml涂布于含萘的分離培養(yǎng)基上；封好涂布后的平板，30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3 d～5 d；從平板中挑出生長好的典型菌落，在含萘固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線培養(yǎng)，直到得到形態(tài)一致的純化菌落。

1.4 不同因素對菌株生長及菌株降解石油效率的影響

1.4.1 菌懸液和石油原液的制備

菌懸液的制備：挑取降解菌株，接種在TSB液體培養(yǎng)基中，在30℃165r/min搖床振蕩培養(yǎng)1天離心后，制備成菌懸液備用。

石油原液的制備：取10ml石油原液，加入90ml的石油醚，在60℃~90℃的水浴鍋中加熱溶解，制備成10%的石油原液后待石油醚揮發(fā)盡后備用。

1.4.2 培養(yǎng)液中原油萃取的方法

將培養(yǎng)7天后的搖瓶培養(yǎng)液全部傾入250ml的分液漏斗中，加入適量石油醚，加蓋充分振蕩2min，期間要注意放氣，靜止分層后，棄去下層液體。用適量石油醚將搖瓶中剩余的石油充分溶解后也倒入分液漏斗中，加蓋充分振蕩，注意放氣。靜止待液體充分分層后，棄去下層液體。將上層石油醚萃取液經(jīng)用塞少許脫脂棉，上面放2g無水硫酸鈉的漏斗過濾。濾液放入事先洗凈烘干至恒重稱量后的錐形瓶中。再用少許石油醚沖洗搖瓶，將液體倒入分液漏斗中，重復(fù)前面的操作，直到搖瓶中的石油被抽提干凈為止。然后將裝有抽提液的錐形瓶置于恒溫水浴鍋中在60℃左右的溫度下于通風(fēng)櫥中蒸干石油醚溶劑，干燥至恒重后稱量[7-10]。

降解率計(jì)算式：

降解率=1-(W1-W2)/W0×100%，

W0為初始原油質(zhì)量（g），W1為錐形瓶+樣品中殘油的質(zhì)量（g），W2為錐形瓶的質(zhì)量（g）。

1.4.3 菌液的OD600處的吸光度值測定

取培養(yǎng)7天后的培養(yǎng)液（搖均勻）于比色皿中置于分光光度計(jì)中測定OD600處的值。

1.4.4 不同pH值對菌株的生長及菌株降解石油效率的影響

在50ml錐形瓶中加入25ml的無機(jī)鹽培養(yǎng)基并調(diào)節(jié)pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0，然后分別在pH值不同的錐形瓶中加入2.5ml 10%的石油溶液，使得培養(yǎng)基中石油的終濃達(dá)到1%，接種制備好的菌懸液250ul，在30℃、165r/min搖床培養(yǎng)7天后，測菌液在OD600處的吸光度值，并用重量法測定石油的降解率。

1.4.5 不同鹽濃度對菌株的生長及菌株降解石油效率的影響

在50ml錐形瓶中加入25mlpH為7.0的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，并分別加入2.5ml的1 g·L-1、3 g·L-1、5 g·L-1、7 g·L-1的NaCl溶液，然后分別在鹽濃度不同的錐形瓶中加入2.5ml 10%的石油溶液，使得培養(yǎng)基中石油的終濃達(dá)到1%，接種制備好的菌懸液250ul，在30℃、165r/min搖床培養(yǎng)7天后，測菌液在OD600處的吸光度值，并用重量法測定石油的降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離篩選的萘降解菌菌落的形態(tài)特征

經(jīng)富集、分離獲得能以萘作為唯一碳源和能源生長的一株菌株，觀察菌落的形態(tài)特征（圖1）。菌落呈淡黃色、圓形、光滑突起、飽滿、邊緣整齊的形態(tài)并且易挑取。

圖1 平析中耐鹽性菌落的形態(tài)的光學(xué)顯微鏡照片

2.2 不同因素對菌株生長及菌株降解石油效率的影響

2.2.1 pH值對菌株生長及對菌株降解石油效率的影響

pH值會(huì)影響降解酶的空間構(gòu)象，pH值的變化對酶活性的揮發(fā)有一定的影響。pH值還能調(diào)節(jié)菌體細(xì)胞對培養(yǎng)基質(zhì)的利用速度和細(xì)胞的狀態(tài)，從而改變菌體的生長速度和微生物細(xì)胞的代謝途徑。通常微生物只能在特定的PH值范圍內(nèi)生長，該范圍的寬窄可在一定程度上反映微生物對環(huán)境適應(yīng)能力的強(qiáng)弱[11]。

圖2 不同pH對菌株生長的影響

圖3 不同pH對菌株降解石油效率的影響

如圖2所示，pH值對菌株的生長具有顯著的影響。在pH值為5~7之間時(shí)，菌株的生長呈上升趨勢，并且pH為7時(shí)生長值達(dá)到最大，隨著pH值的繼續(xù)升高，菌株的生長狀況又有所下降。pH對菌株降解石油的效率也有很大的影響，如圖3所示，當(dāng)pH值為7時(shí)，降解率可達(dá)21.79%，此后隨著pH值繼續(xù)升高，菌株的生長受到抑制，對石油的降解率也隨之下降。這說明中性環(huán)境更有利于萘降解菌的生長，能更有效地降解石油。

2.2.2 鹽濃度對菌株生長及對菌株降解石油效率的影響

鹽脅迫對菌體的的毒害作用包括兩個(gè)方面：其一是產(chǎn)生離子毒害，在菌體內(nèi)積累Na+，其二是產(chǎn)生滲透脅迫，使質(zhì)膜的跨膜片滲透壓降低而導(dǎo)致細(xì)胞膨壓的喪失[12]。菌體細(xì)胞主要通過學(xué)習(xí)Na+的外流、Na+在囊泡中的區(qū)隔化、增加質(zhì)膜K+的吸收而限制Na+的吸收、調(diào)節(jié)相容性滲調(diào)劑和滲透保護(hù)劑的合成和積累，以及脅迫蛋白的表達(dá)對鹽脅迫產(chǎn)生應(yīng)答[13-14]。

圖4 不同NaCl濃度對菌株生長的影響

圖5 不同NaCl濃度對菌株降解石油效率的影響

如圖4所示，菌株在NaCl質(zhì)量濃度為3 g·L-1以下時(shí)生長良好，而大于此濃度時(shí)，菌體會(huì)因不同程度的失水，使生長菌株生長受到抑制。如圖5所示，當(dāng)NaCl濃度為3g·L-1時(shí)，對石油的降解效率較高，可達(dá)15.98%。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為7 g·L-1時(shí)，對石油的降解率僅為9.67%。這說明NaCl濃度對石油的降解率有直接影響，濃度高使石油降解菌的生長受到了抑制，也間接的使石油降解率下降。

3 結(jié)論與討論

從長春二道區(qū)中國石油東環(huán)城路加油站附近挖取的被石油副產(chǎn)品污染的土壤中分離篩選出的一株以萘為唯一碳源的萘降解菌，對菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，觀察到菌落呈淡黃色、圓形、光滑突起、飽滿、邊緣整齊的形態(tài)。通過研究不同pH和不同濃度的NaCl溶液對該菌生長情況的影響以及該菌對石油降解效率的影響后得出，該菌對石油具有優(yōu)良的降解性，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速165r/min、pH值為7、NaCl質(zhì)量濃度3g·L-1條件下降解性能最佳。

選擇適度的石油降解耐鹽菌對于環(huán)境保護(hù)具有重要作用。由于在石油開采中，原油為一種混合物，本身就帶著一定的鹽份，不僅對管道造成不同程度的腐蝕，同時(shí)也對土壤造成了一定的鹽害。以前我們往往用物理的或化學(xué)的手段來對落地原油進(jìn)行處理，但是在修復(fù)環(huán)境的同時(shí)也對環(huán)境造成了二次污染。生物處理法是近年來發(fā)展起來的處理石油污染比較好的一種方法，具有處理效果好、費(fèi)用低、對環(huán)境污染小、無二次污染及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。而應(yīng)用微生物來治理石油烴類物質(zhì)的污染，較物理或化學(xué)方法成本較低，投資少，效率高，因此越來越受到普遍重視[15-16]。

我們選擇的耐鹽菌株添加到受污染的土壤中，可以提高原土壤中原油的降解速度，加大降解率。同時(shí)耐鹽菌還可以減輕植物鹽害，增大植物的生長量，間接地對環(huán)境起到修復(fù)作用。

[1]夏星暉，許喜琳.土壤石油烴類污染治理方法評述[J].環(huán)境保護(hù)科學(xué)，1995，21（1）：1-5.

[2]宋雪英,宋玉芳,孫鐵珩,等.石油污染土壤中芳烴組分的生物降解與微生物生長動(dòng)態(tài)[J].環(huán)境科學(xué),2004,25(3):115-119.

[3]屠明明.原油污染土壤降解細(xì)菌的分離鑒定與污染物的生物降解研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2010.

[4]廖雪義，劉秀紅，余海忠.萘降解菌的分離與鑒定[J].襄樊學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，2010，38（5）：2248-2249，2253.

[5]阮志勇.石油降解菌株的篩選、鑒定及其石油降解特性的初步研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2007,30(9):11-13.

[6]唐玉斌，毛莉，呂錫武，等.一株蒽降解菌的分離鑒定及其降解特性研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2007，30（9）：11-13.

[7]周德慶，胡寶龍，祖若夫，等.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：高等教育出版社，2009：128-131.

[8]楊旭，唐玉斌，陳艷芳，等.一株萘降解菌的分離鑒定及其降解特性研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2011，34（10）：43-47.

[9]杜軍，張旭，黃琦.可降解萘細(xì)菌的分離與生長特性分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（35）:17320-17322.

[10]祝慧慧.石油降解細(xì)菌的降解能力以及降解相關(guān)酶活性研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué),2010.

[11]ZhangXF,Oyaizu H.Studyon isolation,identification and characteristics ofpolycyclic aromatic hydrocarbons degradingbacteria[J].Shanghai Environmental Science,2003,22(8):544-547.(in Chinese).

[12]MarquezJ A,Pascual Ahuir A,Proft M,SerranoR.The Ssn6-Tup1 repressor complexofSaccharomyces cerevisiae is involved in the osmotic induction ofHOG-dependent and-independent genes[J].EMBO,1998,(9):2543-2553.

[13]Coossens A,Dever TE,Pascual Ahuir A,SerranoR.The protein kinase Ccnp mediates sodiumtoxicityin yeast[J].Biol Chem,2001,273(33):30753-30760.

[14]SerannoR,Mulet J M,Rios G,MarquezJ A,de Larrinoa I,Leube M,Mendizabal I,Pascual-Ahuir A,Proft M,Ros R,Montesinos C.Aglimpse ofthe mechanisms ofion homeostasis duringsalt stress[J].Experimental Botany,1999,50(special issue):1023-1036.

[15]李凱峰,溫青,夏淑梅.石油污染土壤的生物處理技術(shù)[J].應(yīng)用科技,2002,29(10):62-64.

[16]李麗,張利平,張?jiān)?石油烴類化合物降解菌的研究概況[J].微生物學(xué)通報(bào),2001,28(5):89-92.