陳紅梅

(安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶 246011)

蓮（Nelumbium nuciferum）為睡蓮科多年生水生草本植物，在我國有廣泛的種植面積。蓮房（lotus seed pod,LS）為其干燥成熟花托，具有化瘀止血袪濕功效，可用于尿血、產(chǎn)后瘀阻等治療[1]。目前蓮房除少數(shù)被民間作為食物香料使用外，大部分被丟棄，造成了資源浪費，也嚴重影響了環(huán)境。近年來研究報道，蓮房中含有槲皮素、槲皮素-3-二葡萄糖苷、金絲桃苷等黃酮類化合物[2]。黃酮類化合物具有抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、降血脂等作用[3-4]，有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。

大孔吸附樹脂是一種人工合成的多孔性的有機高分子聚合物[5-6]，因其具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、吸附選擇性強、解吸溫和、再生容易、價格低廉等優(yōu)點，而被廣泛用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域物質(zhì)的分離純化中[7-9]。目前未見有采用大孔樹脂對蓮房黃酮進行分離純化的報道。本實驗采用微波輔助提取法對蓮房黃酮進行提取，并利用大孔樹脂對蓮房黃酮類化合物進行純化，為充分開發(fā)利用蓮房黃酮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蓮房，購于農(nóng)貿(mào)市場，烘干粉碎后過50目篩，備用。

大孔樹脂：AB-8、NKA-9、S-8、X-5、H103購于南開大學(xué)化工廠；D101、HPD-826、HPD-722購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司；蘆丁標準品購自上海生化制品廠；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

UV-2000型紫外-可見分光光度計，上海尤尼柯公司；FA2004A型電子天平，上海精天電子儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蓮房黃酮提取工藝及含量測定

準確稱取蓮房粉末5.0g放入磨口三角燒瓶中，按料液比1∶1的比例加入70%的乙醇溶液，在350W的微波功率下提取100s，減壓蒸餾，濃縮液用石油醚脫色2次后再次過濾，濾渣用70%乙醇溶解并定容至50mL，按“1.3”進行操作，根據(jù)測定的吸光度計算黃酮含量。

1.2.2 標準曲線的制作

準確稱取蘆丁標準品20mg，用70%的乙醇溶解并定容至50mL。精密吸取上述溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于25mL容量瓶中，分別加入5%的亞硝酸鈉溶液2mL，混勻后靜置6min，再加入10%的硝酸鋁溶液2mL，混勻后靜置6min，再加入4%的氫氧化鈉溶液2mL，最后用70%乙醇定容，在510nm處測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度（C:mg·mL-1)為橫坐標，所測吸光度(A)為縱坐標，得到回歸方程：A=0.2969C-0.2945，R2=0.9994。

1.2.3 樹脂的預(yù)處理

將樹脂置于95%乙醇溶液中浸泡20h以上，使其充分溶脹，濕法裝柱，再用乙醇淋洗，觀察洗出液加水后是否變澄清液體，澄清后改用蒸餾水淋洗，洗至無醇味，備用。

1.2.4 樹脂吸附率和解吸率測定

取250mL的磨口三角瓶，準確稱取5.0g預(yù)處理的濕樹脂放入其中，再加入50mL蓮房黃酮水溶液，蓋上瓶塞，置于恒溫水浴震蕩器上，充分震蕩24h，待溶液達到吸附平衡后，過濾，收集濾液，測定溶液中黃酮的濃度，按下式計算樹脂的吸附率。

式中Q為吸附量（mg·g-1）；C0為黃酮液初始質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；C1為吸附平衡后溶液中的黃酮質(zhì)量濃度（mg·mL-1）。

取250mL的磨口三角瓶，將上述吸附飽和的樹脂，先用蒸餾水洗滌后，再加入95%的乙醇溶液50mL，置于恒溫水浴震蕩器上，充分震蕩24h，過濾，測定濾液中黃酮濃度，按下式計算樹脂的解吸率。

式中Ce為洗脫液黃酮濃度（mg·mL-1）；Ve為洗脫液體積（mL）；C0為黃酮液初始質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；C1為吸附平衡后溶液中的黃酮質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；V為吸附溶液體積（mL）。

1.2.5 靜態(tài)吸附動力學(xué)特性測定

取250mL的磨口三角瓶，準確稱取5.0g預(yù)處理的濕樹脂放入其中，再加入50mL蓮房黃酮水溶液，置于恒溫水浴震蕩器上震蕩9h，每隔1h吸取一定體積的溶液，測定其中黃酮含量，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

1.2.6 動態(tài)吸附實驗

1.2.6.1 樣液濃度對吸附的影響

將預(yù)處理的樹脂上柱，將10mL濃度分別為0.5、1、1.5、2mg·mL-1的黃酮溶液以2BV/h的流速加入，每5mL收集一管，測定吸附率。

1.2.6.2 流速對吸附的影響

將預(yù)處理的樹脂上柱，將10mL 1.0mg·mL-1的黃酮溶液分別以1、2、3、4BV·h-1的流速加入，每5mL收集一管，測定吸附率。

1.2.6.3 pH對吸附的影響

將預(yù)處理的樹脂上柱，分別調(diào)節(jié)1.0mg·mL-1黃酮溶液pH值至2.5、3.5、4.5、5.5，取10mL以2BV·h-1的流速加入，每5mL收集一管，測定吸附率。

1.2.7 動態(tài)洗脫實驗

1.2.7.1 乙醇濃度對洗脫的影響

將預(yù)處理的樹脂上柱，取10mL 1.0mg·mL-1的黃酮溶液加入，用蒸餾水洗滌至流出液近無色，分別用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液以2BV·h-1的流速進行洗脫。

1.2.7.2 洗脫速率對洗脫的影響

將預(yù)處理的樹脂上柱，取10mL1.0mg·mL-1的黃酮溶液加入，用蒸餾水洗滌至流出液近無色，用75%的乙醇溶液分別以1、2、3、4BV·h-1的流速進行洗脫。

1.2.7.3 動態(tài)洗脫曲線

將處理好的樹脂裝柱后，取黃酮溶液5mL上柱，用蒸餾水洗滌至流出液近無色，再用75%的乙醇溶液以2BV/h的流速洗脫，第1BV收集一管，測定每管中黃酮的濃度，繪制動態(tài)洗脫曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同大孔樹脂的吸附和解吸附效果

在相同條件下對8種大孔樹脂進行吸附和解吸附能力測定，結(jié)果如表1所示。其中AB-8、X-5、HPD-826、HPD-722具有較高的吸附率，都在80%以上，其中以AB-8的吸附率最大；AB-8、NKA-9、D101、X-5、HPD-722、H103具有較高的解吸率，其中以NKA-9的解吸率最高，達到92.7%，但其吸附率只有73.1%。在選取的8種樹脂中，以AB-8、X-5、HPD-722這3種樹脂同時表現(xiàn)出較好的吸附效果和解吸附效果。綜合考慮，初選AB-8、X-5、HPD-722作吸附動力學(xué)特性測定。

表1 大孔樹脂吸附率與解吸率比較

2.2 靜態(tài)吸附動力學(xué)特性測定

對AB-8、X-5、HPD-722樹脂進行吸附動力學(xué)測定，結(jié)果如圖1所示。從3種樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線可知，AB-8、X-5和HPD-722均為吸附快速平衡型，三者在4h左右基本達到吸附平衡，但AB-8的吸附率始終要高于X-5和HPD-722樹脂，表現(xiàn)出更好的吸附動力學(xué)特性，因此選擇AB-8樹脂作進一步的研究。

圖1 大孔樹脂吸附動力學(xué)曲線

圖2 黃酮濃度對吸附效果的影響

2.3 AB-8樹脂動態(tài)吸附試驗

2.3.1 樣液濃度對AB-8樹脂吸附效果的影響

不同樣液濃度對AB-8樹脂吸附效果的影響見圖2。隨著樣液濃度的增加，樹脂對黃酮的吸附率也隨之升高。但當(dāng)樣液濃度達到1.5mg·mL-1時，繼續(xù)增加樣液濃度，吸附率呈緩慢增加趨勢?？紤]到樣液濃度太大時有可能會使樹脂堵塞，故選擇樣液濃度為1.5mg·mL-1。

2.3.2 流速對AB-8樹脂吸附效果的影響

不同上樣流速對AB-8樹脂吸附效果的影響見圖3。隨著上樣流速的增加，樹脂的吸附率呈下降趨勢。流速慢，樣液能與樹脂充分結(jié)合，樹脂的吸附率增加。當(dāng)流速為1BV·h-1時，樹脂的吸附率為77.8%。流速的增加可以提高工作效率，當(dāng)流速增加到3BV·h-1時，樹脂的吸附率為73.5%；而當(dāng)流速增加到43BV·h-1時，樹脂的吸附率下降較多。綜合考慮樹脂吸附率和工作效率，選取上樣流速為3BV·h-1較為合適。

2.3.3 樣液pH值對AB-8樹脂吸附效果的影響

pH的影響主要與溶質(zhì)的酸堿性質(zhì)相關(guān)，黃酮類化合物屬弱酸性化合物，根據(jù)“相似相溶”的規(guī)則，宜選擇在酸性溶液中進行吸附。樣液pH值對AB-8樹脂吸附效果的影響見圖4。由圖4可知，pH值為3.5時，樹脂的吸附率最高。

圖3 流速對AB-8樹脂吸附效果的影響

圖4 pH對AB-8樹脂吸附效果的影響

2.4 動態(tài)洗脫試驗

2.4.1 乙醇濃度對洗脫效果的影響

乙醇濃度對洗脫效果的影響如圖5所示，由圖5可知，隨著乙醇濃度的增加，洗脫率也呈增加趨勢。這可能是因為乙醇濃度增加，減弱了黃酮類物質(zhì)與樹脂之間的吸附作用。當(dāng)乙醇濃度為70%時，洗脫率達81.4%，而當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加，洗脫率呈緩慢增加趨勢。因此，考慮到試劑成本，選擇70%的乙醇溶液作為洗脫液，也可以有較好的洗脫效果。

圖5 乙醇濃度對洗脫效果的影響

圖6 流速對洗脫效果的影響

2.4.2 流速對洗脫效果的影響

流速是影響洗脫效果的重要因素之一，流速慢，洗脫效果好，分辨率高，但洗脫時間長，耗時；流速快，洗脫效果變差，分辨率低，但節(jié)約工作時間。因此，選擇合適的洗脫流速也至關(guān)重要。如圖6所示，當(dāng)流速為1BV·h-1時，洗脫率為86.2%；當(dāng)流速為2BV·h-1時，洗脫率為79.4%；當(dāng)流速進一步加快，此時洗脫率也呈快速下降趨勢?？紤]到洗脫效果和洗脫效率，選擇流速為2BV·h-1比較合適。

2.4.3 洗脫曲線的測定

黃酮洗脫曲線如圖7所示，以2BV·h-1的流速洗脫時，所得的洗脫曲線峰型較集中，幾乎沒有拖尾現(xiàn)象。當(dāng)洗脫體積為3BV時，洗脫液中黃酮濃度達到最高值3.041mg·mL-1，當(dāng)洗脫液用量在7BV時基本可以將黃酮洗脫完全。

圖7 動態(tài)洗脫曲線

3 結(jié)論

在所選的AB-8、NKA-9、D101、S-8、X-5、HPD-826、HPD-722、H103樹脂中，AB-8樹脂在對蓮房黃酮液的吸附效果和解吸效果方面均有較好的改良，操作簡單，可以用于蓮房黃酮的純化。

AB-8樹脂對蓮房黃酮的最佳層析條件為：上樣液濃度為1.5mg·mL-1，上樣流速3BV·h-1，樣液pH為3.5，乙醇濃度70%，洗脫流速2BV·h-1。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：257.

[2]國家中醫(yī)藥管理局.中華本草：第八卷[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：405，333.

[3]曹緯國，劉志勤，邵云，等.黃酮類化合物藥理作用的研究進展[J].西北植物學(xué)報，2003，23（12）：2241-2247.

[4]Baglin IMitaine-0 er,NourAC,TanM,et al Areviewofnatural and modied betulinic,ursolic and echinocystic acid derivatives as potential antitumor and anti-HIVagents[J].Mine RevMed Chem,2003,3:525-539.

[5]婁嵩，劉永峰，白清清，等.大孔吸附樹脂的吸附機理.化學(xué)進展，2010，8（24）：1427-1436.

[6]李豈凡、白蘭莉，胥勇，等.葛根總黃酮的分離純化[J].南昌大學(xué)學(xué)報：理科版，2007，31（5）：463-466.

[7]BoqiangFu,Jie Liu,Huan Li,et al.The application ofmacroporous resins in the separation oflicorice flavonoids and glycyrrhizic acid[J].Journal ofChromatographyA,2005,1089(1):18-24.

[8]GuangTJ,Xiu YL.Enrichment and purification ofmadecassoside and asiaticoside fromCentella asiatica extracts with macroporous resins[J].Journal ofChromatographyA,2008,1193(1-2):136-141.

[9]王曉林，鐘方麗，李敦猛，等.廣金錢草中總黃酮提取工藝研究[J].中藥材，2008，31（6）：900-902.