孫嶸，馬瓊，杜麗，蔡金玲，楊曉云，高艷，崔玉芳，毛建平

·軍事醫(yī)學(xué)·

毫米波輻照所致急性應(yīng)激對(duì)小鼠細(xì)胞因子和Th1/Th2免疫平衡的影響

孫嶸，馬瓊，杜麗，蔡金玲，楊曉云，高艷，崔玉芳，毛建平

目的探討35GHz毫米波輻照誘發(fā)的小鼠急性應(yīng)激細(xì)胞因子，尤其是Th1/Th2型因子的變化規(guī)律及其對(duì)免疫平衡的影響。方法BALB/c小鼠經(jīng)35GHz、420mW/cm2功率密度的毫米波源急性輻照60s，紅外監(jiān)測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠背部皮膚溫度變化。于輻照后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)小鼠外周血象、胸腺及脾臟指數(shù)，并用ELISA法檢測(cè)血清中IL-1β、IL-2、IL-6及Th1/Th2型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的變化。結(jié)果輻照開始后小鼠耳廓溫度迅速升高到50℃，至輻照50～60s時(shí)升至約60℃。輻照后6h外周血白細(xì)胞(WBC)和淋巴細(xì)胞(LYM)出現(xiàn)明顯的一過性降低，至輻照后1～7d基本恢復(fù)至對(duì)照水平。胸腺指數(shù)在輻照后6h短暫升高后逐漸降低，至輻照后7d明顯低于對(duì)照組。脾臟指數(shù)在輻照后3、7d均出現(xiàn)明顯升高。外周血IL-1β在輻照后6h即迅速升高至峰值，1d降至最低(P＜0.05)，3～7d逐漸恢復(fù)至對(duì)照水平；而IL-6在輻照后6h～3d明顯升高，1d升至峰值，7d仍明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。Th1和Th2型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4在輻照后3d均升高至峰值，至7d仍明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)比值在輻照后1、3d分別增高為對(duì)照值的1.34和1.66倍(P＜0.05)。結(jié)論35GHz毫米波急性輻照小鼠能誘發(fā)明顯的熱效應(yīng)，血清細(xì)胞因子應(yīng)激性升高，Th1/Th2平衡明顯向Th1免疫方向偏移，表明免疫調(diào)節(jié)在毫米波輻照誘發(fā)的急性應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。

毫米波；應(yīng)激；細(xì)胞因子類；免疫平衡

因毫米波(millimeter-wave，MMW)具有頻率高、波長(zhǎng)短、有一定穿透力的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于無(wú)線通信、醫(yī)學(xué)、軍事等領(lǐng)域。目前，毫米波的生物效應(yīng)及相關(guān)的防護(hù)研究備受關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)，毫米波輻照可引起體表溫度升高[1-2]，而高功率毫米波輻照對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)影響的報(bào)道鮮見。免疫系統(tǒng)及其分泌的免疫因子組成了一個(gè)龐大、復(fù)雜而有序的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其穩(wěn)態(tài)調(diào)控對(duì)機(jī)體適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境變化、特別是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。Th1和Th2型輔助性T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。然而，急性應(yīng)激時(shí)機(jī)體所產(chǎn)生的糖皮質(zhì)激素對(duì)Th1/Th2免疫平衡的影響，能直接誘發(fā)機(jī)體對(duì)疾病的易感性[4]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)觀察35GHz毫米波輻照誘發(fā)的小鼠急性應(yīng)激反應(yīng)中的重要細(xì)胞因子，尤其是Th1/Th2型因子的變化規(guī)律，并重點(diǎn)分析Th1/ Th2免疫平衡的變化特點(diǎn)，以期能為毫米波誘發(fā)的免疫損傷機(jī)制及其醫(yī)學(xué)防護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性二級(jí)BALB/c小鼠30只，體重20±2.0g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并飼養(yǎng)于該中心二級(jí)動(dòng)物房。按照取材時(shí)間分為對(duì)照組、6h組和1、3、7d共5組，每組6只。

1.2 主要試劑 小鼠IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6及IFN-γ的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司。

1.3 輻照條件 小鼠背部剪毛后束縛四肢，采用35GHz、平均功率密度420mW/cm2的毫米波源進(jìn)行輻照。輻照時(shí)間60s，對(duì)照組行假照射。輻照全程使用紅外監(jiān)測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠背部皮膚溫度變化，并用視頻監(jiān)控系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其行為學(xué)變化。

1.4 外周血血象分析 分別于輻照后5h和1、3、7d取小鼠尾靜脈血20μl，以全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血象的變化。

1.5 臟器指數(shù) 分別于輻照后6h和1、3、7d將小鼠稱重，取血后脫頸處死，解剖取出胸腺、脾臟稱重。根據(jù)公式[臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/體重(g)×100%]計(jì)算臟器指數(shù)。

1.6 ELISA法檢測(cè)血清細(xì)胞因子含量 分別于輻照后6h和1、3、7d經(jīng)眼眶取血，離心收集血清，參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6及IFN-γ等細(xì)胞因子的檢測(cè)。具體步驟如下：將標(biāo)本及不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板，37℃孵育90min；洗板后加入生物素化抗體工作液，37℃孵育60min；洗板后加入酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30min；洗板后加入顯色劑，避光孵育10～15min后加入終止液，混勻后在酶標(biāo)儀上測(cè)量450nm處的吸光度(A)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 輻照過程中小鼠體表溫度和行為學(xué)變化 輻照前，小鼠無(wú)明顯躁動(dòng)，體表溫度約為32℃(圖1A)。輻照開始后10～20s，小鼠即出現(xiàn)躁動(dòng)不安，揚(yáng)頸，耳廓溫度迅速升高到50℃以上(圖1B)。輻照50～60s時(shí)耳廓溫度升高到60℃，背部局部溫度也升高至約50℃(圖1C)。而輻照90s后，紅外監(jiān)測(cè)顯示小鼠整個(gè)背部溫度均超過50℃(圖1D)。同時(shí)小鼠出現(xiàn)四肢僵硬、尾部上翹現(xiàn)象。所有輻照90s的小鼠存活均未超過24h。

圖1 毫米波急性輻照后小鼠體表溫度和行為學(xué)變化Fig.1 Changes of mouse shell temperature and ethology after acute MMW radiation

2.2 外周血象變化 小鼠外周血白細(xì)胞(WBC)在輻照后6h出現(xiàn)一過性降低(P＜0.05)，1d后逐漸恢復(fù)至正常水平。淋巴細(xì)胞(LYM)絕對(duì)數(shù)呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，而RBC輻照后未觀察到明顯改變(表1)。

表1 毫米波急性輻照后小鼠外周血象的變化s,n=6)Tab.1 Changes of peripheral haemogram after acute MMW radiation (±s,n=6)

表1 毫米波急性輻照后小鼠外周血象的變化s,n=6)Tab.1 Changes of peripheral haemogram after acute MMW radiation (±s,n=6)

(1)P＜0.05 compared with control group

GroupRBC(×1012/L)WBC(×109/L)LYM(×109/L) Control10.00±1.347.93±1.167.87±1.18 6h9.87±1.86 4.63±0.15(1)4.53±0.15(1)1d9.86±0.167.50±0.307.40±0.30 3d9.77±1.057.83±0.957.43±0.55 7d9.30±0.897.73±0.357.63±0.35

2.3 脾臟和胸腺指數(shù)變化 輻照后3、7d小鼠脾臟指數(shù)明顯高于對(duì)照組(表2)；而胸腺指數(shù)在輻照后6h即出現(xiàn)顯著升高(P＜0.01)，隨后逐漸降低，至7d時(shí)明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。

表2 毫米波急性輻照后小鼠臟器指數(shù)的變化Tab.2 Changes of mouse organ index after acute MMW radiation

2.4 外周血IL-1β、IL-6和IL-2含量的變化 輻照后6h，IL-1β即出現(xiàn)顯著升高(P＜0.05)，輻照后1d降至最低(P＜0.01)，3d后開始回升，至7d接近正常水平。IL-6在急性輻照后6h即明顯升高，1d升至峰值(P＜0.01)，而后出現(xiàn)下降，然而直至7d仍明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。IL-2水平在輻照后未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的變化(圖2)。

圖2 毫米波急性輻照后小鼠血清IL-1β、IL-6和IL-2含量變化Fig.2 Changes of mouse serum IL-1β, IL-6 and IL-2 levels after acute MMW radiation

2.5 外周血Th1/Th2型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4含量的變化 IFN-γ在急性輻照后6h即出現(xiàn)明顯升高(P＜0.05)，3d達(dá)到峰值，7d時(shí)下降但仍明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。而IL-4在輻照后1～7d持續(xù)升高，均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01，圖3A)。

2.6 外周血Th1/Th2比值的變化 由于毫米波急性輻照后IFN-γ和IL-4各自升高的幅度不同(輻照后1、3d IFN-γ升高，分別為對(duì)照組的1.66和2.22倍，而IL-4僅為對(duì)照組的1.24和1.35倍)，導(dǎo)致Th1/ Th2(IFN-γ/IL-4)比值的顯著增高，輻照后1、3d該比值分別為對(duì)照值的1.34和1.66倍(P＜0.05)，即發(fā)生了明顯的Th1/Th2模式向Th1免疫反應(yīng)偏移的現(xiàn)象(圖3B)，至輻照后7d恢復(fù)至正常水平。

3 討 論

圖3 毫米波急性輻照后小鼠外周血IL-4、IFN-γ含量(A)及Th1/Th2比值(B)的變化Fig.3 Changes of mouse serum IL-4, IFN-γ content (A) and Th1/Th2 ratio (B) after acute MMW radiation

毫米波頻率高，趨膚深度較小，可在皮膚局部產(chǎn)生明顯的熱效應(yīng)[5]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到35GHz毫米波輻照短時(shí)間內(nèi)小鼠耳廓溫度迅速升高到50℃，至輻照50～60s時(shí)約升高至60℃，顯示急性毫米波輻照引起了明顯的熱效應(yīng)。這種熱效應(yīng)不僅能引起局部的皮膚損傷，輻照時(shí)間達(dá)90s時(shí)可導(dǎo)致小鼠在24h內(nèi)死亡，這一結(jié)果與王立斌等[6]及徐志偉等[7]的研究結(jié)果相同，這可能與毫米波急性輻照后動(dòng)物體溫急劇升高、生理狀態(tài)及免疫功能急劇變化有關(guān)。據(jù)此在本實(shí)驗(yàn)中采用35GHz毫米波輻照60s后觀察小鼠外周血象及細(xì)胞因子的變化規(guī)律，重點(diǎn)分析Th1/ Th2免疫平衡在急性輻照后的變化。

本實(shí)驗(yàn)觀察到輻照后6h，小鼠外周血WBC、LYM出現(xiàn)一過性降低，可能是機(jī)體對(duì)毫米波急性輻照的全身性應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果。同時(shí)還觀察到胸腺指數(shù)早期(6h)即升高而后期(3～7d)則降低，而脾臟指數(shù)在輻照后3～7d時(shí)才出現(xiàn)明顯升高，表明毫米波輻照后，不同免疫器官顯示出不同的應(yīng)激反應(yīng)，作為中樞免疫器官的胸腺對(duì)急性毫米波輻照顯示出較高的敏感性，而脾臟作為外周免疫器官其臟器指數(shù)的增加，可能是應(yīng)激誘導(dǎo)的代償性增殖，抑或是在本實(shí)驗(yàn)輻照條件下毫米波可能對(duì)免疫系統(tǒng)具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用。

已知在熱應(yīng)激過程中能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，而且與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的應(yīng)激調(diào)節(jié)密切相關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，毫米波急性輻照所致的熱應(yīng)激不僅可引起IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子出現(xiàn)規(guī)律性改變，而且能使機(jī)體的免疫平衡發(fā)生改變。有文獻(xiàn)報(bào)道，IL-1β、IL-2和IL-6不僅具有多種免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，而且還可以作用于下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)的不同位點(diǎn)，產(chǎn)生神經(jīng)內(nèi)分泌效應(yīng)[9]。而Th1/Th2免疫平衡調(diào)節(jié)在神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的交互通訊中起著重要作用[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-1b、IL-6、IFN-γ和IL-4在毫米波急性輻照后0.25d即迅速升高，表明一方面小鼠細(xì)胞因子應(yīng)激性合成分泌增加，另一方面這種增加可能與機(jī)體早期的炎癥反應(yīng)有關(guān)。隨后(1d)IL-1β濃度雖明顯降低，但與機(jī)體炎癥反應(yīng)相關(guān)的IL-6、IFN-γ和IL-4濃度仍明顯高于對(duì)照水平。然而，由于IFN-γ和IL-4升高的幅度不同，導(dǎo)致輻照后Th1/Th2比值出現(xiàn)顯著增高，即發(fā)生了Th1/Th2免疫平衡模式向Th1免疫反應(yīng)明顯偏移的現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，毫米波輻照急性應(yīng)激不僅引起小鼠體內(nèi)重要細(xì)胞因子發(fā)生改變，而且能使Th1/Th2免疫平衡系統(tǒng)發(fā)生明顯改變，導(dǎo)致機(jī)體防御功能紊亂。而毫米波輻照后7d，Th1/Th2免疫平衡的恢復(fù)可能與機(jī)體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)間的相互調(diào)節(jié)作用有關(guān)，這一推論尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，小鼠經(jīng)420mW/cm2毫米波急性輻照可引起明顯的熱效應(yīng)，IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-4等細(xì)胞因子應(yīng)激性升高，Th1/Th2免疫平衡改變，該結(jié)果為毫米波免疫損傷的機(jī)制及靶向研究提供了重要依據(jù)。

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Changes of mouse cytokines and Th1/Th2 balance in acute stress induced by millimeter-wave

SUN Rong, MA Qiong, DU Li*, CAI Jin-ling, YANG Xiao-yun, GAO Yan, CUI Yu-fang, MAO Jian-ping
Institute of Radiation and Irradiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China
*

, E-mail: lily5847@163.com
This work was supported by Open Issues of State key Laboratory of Millimeter Waves (K200909, K201225)

ObjectiveTo explore the regular pattern of variation of cytokines, especially the Th1/Th2 cytokines, and its effect on immune balance in stress induced by 35GHz millimeter-wave (MMW) exposure in mice.MethodsBALB/c mice were exposed to 420mW/cm2, 35GHz MMW for 60s, and the dorsal skin temperature was real-time monitored with infrared monitor during the period of exposure. Peripheral WBC, thymic and splenic indexes of mice were detected at different time points after MMW exposure. Meanwhile, the contents of serum IL-1β, IL-2, IL-6 and Th1/Th2 cytokines IFN-γ, IL-4 were analyzed by ELISA.ResultsThe temperature of ear auricle rapidly increased to 50℃ after initiation of exposure, and continuously rose to about 60℃at 50s to 60s. Peripheral WBC and lymphocytes showed transient reduction at 6h and restored to the control level from 1 to 7d after radiation exposure. Compared with control group, thymus index displayed a transient increase at 6h and thereafter decreased, and then diminished to which significantly lower than control level 7d after radiation exposure. However, spleen index increased significantly on day 3 and day 7 after radiation exposure. Peripheral IL-1β levels immediately increased to the maximum at 6h and decreased to the minimum at 1d (P＜0.05), then gradually recovered to control level during 3d and 7d after radiation exposure. However, IL-6 level displayed a significant increment from 6h to 3d, and increased to peak value at 1d and still obviously higher than that of control group up to 7d (P＜0.05) after radiation exposure. Simultaneously, Th1/Th2 cytokines IFN-γ and IL-4 both increased to the maximal at 3d and still significantly higher than those of control group at 7d (P＜0.01) after radiation exposure. Ratios of Th1/Th2 (IFN-γ/IL-4) evidently raised to 1.34 and 1.66 times of control values at 1d and 3d respectively (P＜0.05).Conclusions35GHz MMW exposure can induce obvious thermal effects in mice, and serum cytokines increase due to stress, the Th1/Th2balance drifts significantly to Th1 immune response, thus indicating that immune-regulation may play an important regulatory role in acute stress induced by MMW exposure.

millimeter-wave; stress; cytokines; immune balance

Q684

A

0577-7402(2013)10-0859-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.017

2013-06-27；

2013-08-10)

(責(zé)任編輯：李恩江)

毫米波國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(K200909，K201225)

孫嶸，醫(yī)學(xué)博士，助理研究員。主要從事輻射免疫損傷機(jī)制及防護(hù)方面的研究

100850 北京 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所(孫嶸、馬瓊、杜麗、蔡金玲、楊曉云、高艷、崔玉芳、毛建平)

杜麗，E-mail：lily5847@163.com