李郭錦，張路，穆長征，宋小峰，郭敏

大鼠腎缺血再灌注損傷程序性壞死的形態(tài)學觀察

李郭錦，張路，穆長征，宋小峰，郭敏

目的觀察大鼠腎缺血再灌注損傷程序性壞死的形態(tài)學變化。方法應(yīng)用免疫印跡技術(shù)、免疫組織化學染色技術(shù)以及光學和電子顯微鏡技術(shù)對缺血60min再灌注24h的大鼠腎臟進行觀察和分析。結(jié)果免疫印跡分析結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，大鼠腎缺血再灌注后受體相互作用蛋白激酶3(RIPK3)和腫瘤壞死因子受體α(TNFRα)表達增強。缺血再灌注損傷的腎組織內(nèi)出現(xiàn)RIPK3免疫組化染色陽性細胞，主要分布于腎小管上皮。光鏡下皮質(zhì)和髓質(zhì)外帶的腎小管出現(xiàn)了程序性壞死，表現(xiàn)為細胞腫脹，著色蒼白，細胞核固縮。電鏡下程序性壞死表現(xiàn)為細胞質(zhì)腫脹，細胞器腫脹、破碎，含有一個凋亡樣細胞核。結(jié)論大鼠腎臟缺血60min再灌注24h后部分腎小管細胞發(fā)生了程序性壞死，腎組織中RIPK3表達增強。

腎；再灌注損傷；程序性壞死；大鼠

腎缺血再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是誘發(fā)急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的主要原因，如腎移植、腎血管手術(shù)后都可發(fā)生RIRI，從而誘發(fā)AKI[1]。大鼠常用于建立RIRI引起的AKI動物模型，雖然有關(guān)大鼠RIRI引起腎臟細胞損傷的報道很多，但多集中在細胞壞死和細胞凋亡等[2-3]。近年來隨著對細胞死亡機制研究的深入，出現(xiàn)了從生物化學或分子生物學變化角度分類和命名的新的細胞死亡方式。程序性壞死是本世紀初由哈佛大學科研人員發(fā)現(xiàn)的一種細胞死亡方式[4-5]，認為在程序性壞死過程中受體相互作用蛋白激酶(receptor interacting protein kinase，RIPK)的激活起著關(guān)鍵的介導作用。目前發(fā)現(xiàn)RIPK包括RIPK1和RIPK3兩種，二者為同源體，它們的激活是細胞走向程序性壞死的關(guān)鍵[6]。但程序性壞死是否參與了腎缺血再灌注損傷，以及RIRI時RIPK3的表達如何目前鮮見報道。本研究建立了RIRI大鼠模型，應(yīng)用免疫印跡分析、免疫組織化學染色以及光鏡、電鏡技術(shù)對腎組織的程序性壞死進行觀察，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 羊抗大鼠腫瘤壞死因子受體α(tumor necrosis factor receptor α，TNFRα)以及RIPK3單克隆抗體(Abcam公司)；二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物及模型制備 健康SD大鼠10只，雌雄各半，體重200～250g，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。按實驗條件隨機分為兩組，每組5只。缺血再灌注損傷(RIRI)組：苯巴比妥鈉麻醉后開腹，應(yīng)用無損傷血管夾阻斷雙側(cè)腎動脈血流60min后放開；假手術(shù)(Sham)組：手術(shù)過程同前，但不阻斷腎動脈血流。兩組動物關(guān)腹后于無菌條件下飼養(yǎng)24h后取材。

1.2.2 取材 動物麻醉后經(jīng)腹主動脈取血2ml用于腎功能常規(guī)檢查。切取新鮮右腎組織備用，用2.5%多聚甲醛戊二醛經(jīng)腹主動脈逆行灌流左腎，灌流成功后于腎門處冠狀面切開腎臟，一半用于常規(guī)石蠟切片，另一半用于電鏡標本制備。

1.2.3 RIPK3和TNFRα免疫印跡檢測分析 兩組新鮮腎組織加入RIPA裂解液，0℃下剪碎，超聲波粉碎20s后靜置30min，4℃下12 000r/min離心20min，留取上清液，BCA法測定蛋白含量，并按每20μl含50μg蛋白制成樣品，－20℃冰箱保存。取已制備樣品適量加入電泳槽，100V電壓下電泳，轉(zhuǎn)膜，常溫下半干轉(zhuǎn)印，TBST沖洗后，5%小牛血清白蛋白室溫封閉1～2h。分別加入一抗( RIPK3、TNFRα抗體，稀釋度為1:1000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗脫3次，每次5min，分別加入二抗(辣根過氧化酶標記的IgG抗體，稀釋度為1:200)室溫孵育1h，TBST緩沖液洗脫3次，每次5min，ECL發(fā)光顯色，采用β-actin作為內(nèi)參。掃描電泳條帶，凝膠分析軟件分析各目的蛋白條帶吸光度(A)值。用目的條帶與內(nèi)參條帶A值的比值表示待測蛋白含量。

1.2.4 石蠟包埋切片的制備 用于石蠟切片的組織經(jīng)水洗后進行系列乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟定向包埋(使切片呈冠狀面方向)，4～5μm厚切片，部分切片經(jīng)HE染色，光鏡觀察，部分切片用于免疫組織化學染色。

1.2.5 RIPK3的免疫組織化學染色 采用石蠟切片免疫組化Envision法。切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫溶液處理30min去除內(nèi)源性過氧化物酶，高壓修復抗原，滴加1:100稀釋的RIPK3單克隆抗體，4℃過夜，滴加辣根酶標記抗羊多聚體(PV9003)，37℃孵育30min，DAB顯色。以上各步驟之間用0.01mol/L PBS洗滌3次，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。陰性對照用PBS替代一抗。蛋白陽性表達呈棕黃色。

1.2.6 電鏡標本的制備 經(jīng)2.5%多聚甲醛戊二醛固定的腎組織再經(jīng)1%鋨酸后固定，緩沖液水洗3次，每次15min，經(jīng)梯度乙醇脫水、丙酮處理，采用樹脂Epon812包埋。超薄切片機行半薄切片，厚1μm，甲苯胺藍染色，光鏡觀察定位后再行超薄切片，厚70nm，重金屬雙染色，EX1200透射電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 腎功能檢查結(jié)果 RIRI組動物血尿素氮為39.1±2.7mmol/L，血清肌酐318±26mmol/L；Sham組動物血尿素氮為4.2±0.8mmol/L，血清肌酐88±17mmol/L，說明腎缺血60min再灌注24h動物腎功能處于衰竭狀態(tài)。

2.2 免疫印跡檢測分析結(jié)果 RIRI組大鼠腎組織RIPK3和TNFRα蛋白表達(分別為0.6792±0.0379、0.4062±0.0360)與Sham組(分別為0.0458±0.0132、0.0554±0.0102)比較均明顯增強(P＜0.05，圖1)。

圖1 兩組免疫印跡電泳條帶Fig.1 Protein products by immunoblot analysis in two groups of rats

2.3 光鏡觀察結(jié)果

2.3.1 RIPK3免疫組織化學染色結(jié)果 Sham組腎組織呈陰性反應(yīng)；RIRI組腎組織RIPK3陽性部位出現(xiàn)棕褐色沉淀，分布在近端小管和遠端小管細胞近游離面及側(cè)基底膜胞質(zhì)內(nèi)(圖2)。

圖2 兩組RIPK3免疫組織化學染色結(jié)果(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of RIPK3 in two groups of rats (×400)

2.3.2 腎組織學觀察結(jié)果 如圖3所示，Sham組腎小管上皮細胞呈立方形，胞質(zhì)嗜酸性，核大，染色淺；RIRI組腎小管上皮細胞出現(xiàn)腫脹蒼白，細胞輪廓尚可辨認，部分細胞胞質(zhì)呈大空泡狀，固縮的核位于空泡內(nèi)(箭頭所示)，說明RIRI時腎小管上皮細胞發(fā)生了特殊的細胞死亡，即程序性壞死。

圖3 兩組腎組織學觀察結(jié)果(HE ×400)Fig.3 Histopathologic change of renal tissue in two groups of rats (HE ×400)

2.4 電鏡觀察結(jié)果 Sham組腎小管上皮細胞結(jié)構(gòu)正常，細胞呈立方形或錐體形，核染色質(zhì)疏松，線粒體等細胞器結(jié)構(gòu)正常；RIRI組腎小管上皮細胞出現(xiàn)程序性壞死，表現(xiàn)為細胞核染色質(zhì)固縮，細胞質(zhì)腫脹，細胞器如線粒體等也腫脹破碎，有時崩解并大量減少，易與周邊壞死細胞區(qū)別(圖4)。

圖4 兩組腎小管上皮細胞電鏡圖像(×5000)Fig.4 Electron micrographs of proximal tubule cells in two groups of rats (×5000)

3 討 論

大鼠腎缺血60min再灌注24h是國內(nèi)外學者常用的RIRI引致AKI動物模型[7-8]，本研究結(jié)果確認了這一動物模型的建立，腎缺血60min再灌注24h大鼠腎功能處于衰竭狀態(tài)。

程序性壞死是2008年由哈佛大學科研人員發(fā)現(xiàn)的新的細胞死亡方式[4]，2012年被國際細胞死亡分類命名委員會正式接受[5]，其形態(tài)特點為壞死樣細胞質(zhì)含有一個凋亡樣的細胞核(apoptosis-like nucleus)，前者表現(xiàn)為細胞質(zhì)腫脹，細胞器如線粒體等也腫脹變性，嚴重時細胞器崩解消失，后者表現(xiàn)為核染色質(zhì)固縮，有時邊聚[9]。本研究在光鏡和電鏡下觀察到上述程序性壞死出現(xiàn)在缺血再灌注損傷的腎小管上皮細胞，說明缺血60min再灌注24h可引起腎小管上皮細胞發(fā)生程序性壞死。

有研究認為TNFRα是啟動程序性壞死的死亡受體之一，導致程序性壞死的細胞外信號是通過TNFRα接受并組合后導致RIPK激活的，由此細胞發(fā)生程序性壞死[4-6]。本研究的免疫印跡檢測結(jié)果顯示，TNFRα蛋白在缺血60min再灌注24h的腎組織表達增強，提示TNFRα可能是RIRI時引起程序性壞死的死亡受體。

有學者認為在程序性壞死過程中，RIPK的激活起著關(guān)鍵的介導作用[5-6]，即RIPK激活后細胞發(fā)生程序性壞死的可能性增加，因此可作為判定程序性壞死的參考生物指標，也有人認為RIPK激活引起的細胞死亡可稱為RIPK介導的細胞死亡[5-7]。

2012年，美國學者Linkermann等[8]第一次揭示了RIRI可引起腎小管上皮細胞發(fā)生RIPK1介導的細胞死亡，同時應(yīng)用免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)RIRI時RIPK3和RIPK1的表達均增強，但他們沒有對RIRI的腎臟進行RIPK3免疫組織化學染色和電鏡下觀察。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RIRI時RIPK3在腎小管免疫組化染色的表現(xiàn)與Linkermann所見RIRI中RIPK1的表現(xiàn)是一致的。有學者認為單一RIPK1激活不能完成程序性壞死，只有RIPK1先行激活，等待RIPK3激活后二者才形成necrosome，即壞死誘導復合體(necrosisinducing complex)，才能使受損的細胞發(fā)生程序性壞死[7,10]。本研究對RIRI腎組織進行了RIPK3免疫組織化學染色觀察，發(fā)現(xiàn)缺血60min再灌注24h的腎組織出現(xiàn)了RIPK3的陽性表達。

綜上所述，大鼠腎臟缺血60min再灌注24h后腎組織RIPK3表達增強，形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞發(fā)生了程序性壞死，即觀察到了特殊的細胞死亡：壞死樣細胞質(zhì)內(nèi)含一個凋亡樣的細胞核。

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Morphological observation of necroptosis after renal ischemia-reperfusion injury in rats

LI Guo-jin1, ZHANG Lu2, MU Chang-zheng3*, SONG Xiao-feng3, GUO Min3*
1Department of Medical Imageology, Third Affiliated Hospital, Liaoning Medical University, Jinzhou, Liaoning 121001, China
2Department of Nursing, Panjin Vocational and Technical College, Panjin, Liaoning 124010, China
3Department of Histology and Embryology, Liaoning Medical University, Jinzhou, Liaoning 121001, China
*

s. Mu Chang-zheng, E-mail: muchangzheng2008@sohu.com; GUO Min, E-mail: mguo1118@yahoo.com.cn
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31200871), Natural Science Foundation of Liaoning Province of China (201202141), and Science Foundation of Liaoning Medical University (20101311)

ObjectiveTo observe the morphological changes of necroptosis after renal ischemia-reperfusion injury (RIRI) in rats.MethodsImmunoblot analysis, immunohistochemical staining and light and electron microscope were used to observe and analyze necroptosis in the renal tissue after 60min ischemia and 24h reperfusion.ResultsImmunoblot analysis showed that the expression of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3) and tumor necrosis factor receptor α (TNFRα) in the kidney was significantly higher in RIRI group than in sham group. Immunohistochemical staining showed positive cells of RIPK3 in the kidney was evident in RIRI group, which distributed mainly in the renal tubular epithelium. Renal tubular cells undergoing necroptosis were evident in both cortical and outer region of the medulla after 60min ischemia and 24h reperfusion and morphologically featured by necrotic cytoplasm containing an apoptosis-like nucleus under electron microscope.ConclusionNecroptosis occurred in renal tubular cells and the expression of RIPK3 could increase in renal tubular cells in rat after 60min ischemia and 24h reperfusion.

kidney; reperfusion injury; necroptosis; rats

R320.2345

A

0577-7402(2013)10-0792-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.002

2013-06-06；

2013-08-17)

(責任編輯：張小利)

國家自然科學基金(31200871)；遼寧省自然科學基金(201202141)；遼寧醫(yī)學院博士啟動基金(20101311)

李郭錦，碩士研究生。主要從事腎臟生物學方面的研究

121001 遼寧錦州 遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院影像科(李郭錦)；124010 遼寧盤錦 盤錦市職業(yè)技術(shù)學院臨床護理系(張路)；121001 遼寧錦州 遼寧醫(yī)學院組織胚胎學教研室(穆長征、宋小峰、郭敏)

穆長征，E-mail：muchangzheng2008@sohu.com；郭敏，E-mail：mguo1118@yahoo.com.cn