陳 碩，李 誠*，李 娜，付 剛

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

高血壓病是一種常見的多發(fā)病，據(jù)推測目前世界1/4的成年人患有高血壓，這一數(shù)據(jù)預(yù)計到2025年會增加到30%[1]。全球約有760萬人由于高血壓病早逝，約占全球病死率13.5%；由高血壓引起的卒中和缺血性心臟病分別達(dá)54%和47%[2]。高血壓病已成為一個十分嚴(yán)重的社會公共衛(wèi)生問題。天然食品中的降血壓肽通常是由蛋白質(zhì)水解酶在溫和條件下水解蛋白質(zhì)而獲得的一類多肽，具有降壓效果且無副作用。許多動物、植物、微生物蛋白及發(fā)酵食品中都含有豐富的降血壓肽，目前已成功地從牛奶、魚、貝、雞蛋、大豆、清酒和酒粕、玉米、麥胚等食物中分離出了各種不同的ACE抑制肽[3-6]。

我國是一個畜牧業(yè)大國，在肉類生產(chǎn)中，每年產(chǎn)生近2000萬t的各類畜禽骨，絕大多數(shù)的畜禽骨沒有得到充分利用[7]。這不僅浪費了寶貴的蛋白質(zhì)資源，而且對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。目前，對骨的開發(fā)利用多集中在對骨鈣研究，而骨蛋白質(zhì)多集中于調(diào)味品和營養(yǎng)強(qiáng)化方面的研究開發(fā)[8-9]，而功能性方面的深入研究報道較少。利用現(xiàn)代高新技術(shù)開發(fā)高附加值的降壓產(chǎn)品，進(jìn)一步提高副產(chǎn)物的利用率，對副產(chǎn)制品的工業(yè)化和生態(tài)環(huán)境保護(hù)都具有重要意義。

根據(jù)本實驗前期研究，與豬骨其他部位比較，豬股骨頭膠原蛋白水解物具有較好的短期降壓效果。因此本實驗選用豬股骨頭制備膠原多肽，以自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血壓為指標(biāo)，確定降壓效果最佳的豬股骨頭膠原蛋白多肽濃度，并通過連續(xù)灌胃實驗驗證其長期降壓效果，為進(jìn)一步研究利用豬股骨頭膠原蛋白開發(fā)降壓產(chǎn)品提供參考和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬股骨頭購自雅安農(nóng)貿(mào)市場。

胰蛋白酶(Trypsin 1：250) 美國Amresco公司；卡托普利(Captopril) 汕頭金石制藥廠。

SHR，雌性，10周齡，體質(zhì)量(165±10)g，購自北京維通利華公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BP-98A智能無創(chuàng)血壓計 日本Softron公司；BR4i型多功能冷凍離心機(jī)、POWERDRY PL 3000凍干機(jī) 美國Thermo公司；UV-2102 PCS型紫外-可見分光光度計 美國Unico公司；超濾離心管(膜截留分子質(zhì)量5000、10000D) 美國Millipore公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 中國金壇市富華儀器有限公司；BT-12S電子天平 德國Sartorius公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 中國金壇市富華儀器有限公司；PHS-3C酸度計 中國方舟科技公司；海爾臥式冷藏冰柜 中國青島海爾集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 豬股骨頭膠原多肽制備

豬股骨頭膠原蛋白多肽參照魏庭浩[10]的方法，將新鮮豬股骨頭進(jìn)行碎骨、脫脂、浸酸、浸灰和中和淌干后，用0.5%的H2O2在100℃、pH8.0條件下處理7h提取膠原蛋白，再采用胰蛋白酶在溫度50℃、pH7.5、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、酶底比8000U/g的條件下酶解豬骨膠原蛋白6h。采用超濾分級的方法分離純化酶解液中的降血壓肽，取超濾離心后分子質(zhì)量小于5000D的肽段冷凍干燥后制得。

1.3.2 單次灌胃實驗

將SHR適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為8組，每組8只：陰性對照組(NC)灌胃蒸餾水；A、B、C、D、E、F組，分別按20、30、40、50、60、70mg/kg劑量灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產(chǎn)物(用蒸餾水溶解)；陽性對照組(PC)灌胃10mg/kg卡托普利懸濁液。灌胃前用尾動脈血壓測量器測定每只SHR尾動脈血壓，然后空腹灌胃相應(yīng)劑量溶液，灌胃后每2h分別測定各組SHR尾動脈收縮壓。選取降壓效果較好的3個劑量組作為連續(xù)灌胃的實驗組。

1.3.3 連續(xù)灌胃實驗

將SHR適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成5組，每組8只：陰性對照組(NC)灌胃蒸餾水；實驗組為低劑量組(L)、中劑量組(M)、高劑量組(H)，按照30、50、70mg/(kg·d)劑量灌胃豬骨膠原蛋白水解產(chǎn)物(用蒸餾水溶解)；陽性對照組(PC)灌胃10mg/(kg·d)卡托普利懸濁液。每天同一時間空腹灌胃相應(yīng)劑量溶液，每5d采用尾動脈血壓測量器分別測定各組SHR尾動脈血壓(灌胃前測量)。連續(xù)灌胃30d。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 單次灌胃對SHR收縮壓的影響

表1 單次灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產(chǎn)物對 SHR收縮壓的影響(±s)Table 1 Effect of single administration of collagen hydrolysates from swine femur head on the systolic pressure of spontaneous hypertension rats (±s) mmHg

表1 單次灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產(chǎn)物對 SHR收縮壓的影響(±s)Table 1 Effect of single administration of collagen hydrolysates from swine femur head on the systolic pressure of spontaneous hypertension rats (±s) mmHg

注：*.與本組灌胃前相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與本組灌胃前相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。

組別 灌胃前 灌胃后2h4h6h8h10h NC154.5±9.1154.3±14.8151.6±5.7156.6±7.9152.0±9.1153.0±13.3 A154.9±10.3 156.4±7.8 153.8±11.3 156.9±8.2156.3±8.0 150.4±5.5 B158.9±6.5 154.2±5.4 151.4±7.6* 149.9±11.6** 151.7±9.7 148.7±9.6*C156.9±12.2 147.2±11.8** 149.2±10.6** 149.3±11.7* 154.8±10.1 147.1±9.7 D157.4±14.6150.9±9.4 144.8±12.7** 138.2±15.2** 150.2±11.0* 152.3±7.4 E160.7±7.4160.1±8.4 153.1±7.8** 153.2±11.1** 157.3±9.9* 140.7±12.1** F160.4±11.9159.9±6.8 155.3±14.4 145.4±13.5** 142.1±18.5** 140.4±19.2** PC158.8±6.5 148.1±6.6** 141.7±10.0** 146.6±9.2** 142.9±12.1** 136.6±7.7**

由表1可知，與灌胃前收縮壓比較，A組沒有顯著的降壓效果；B組在灌胃后4h收縮壓出現(xiàn)顯著下降，至10h時下降值最大，達(dá)到10.2mmHg；C組在灌胃后2h收縮壓出現(xiàn)極顯著下降，下降最大值達(dá)到9.7mmHg；D組在灌胃后4h出現(xiàn)極顯著下降，至6h時下降值最大，達(dá)到19.2mmHg；E組在灌胃后4h出現(xiàn)極顯著下降，至10h時下降值最大，達(dá)到20.0mmHg；F組在灌胃后6h出現(xiàn)極顯著下降，至10h時下降值達(dá)到20.0mmHg?？梢?個實驗組除A組沒有顯著降壓效果外，其他各組均有不同程度的降壓效果。選擇30、50、70mg/kg劑量，分別作為多次灌胃的低劑量組、中劑量組和高劑量組。

2.2 連續(xù)灌胃對SHR血壓的影響

2.2.1 連續(xù)灌胃對SHR收縮壓的影響

由表2可知，與同時段陽性對照組比較，各劑量組收縮壓總體上無顯著差異。與同時段陰性對照組比較，低、中、高劑量組SHR收縮壓均出現(xiàn)極顯著降低，且穩(wěn)定持續(xù)降低。其中，低劑量組在30d時降壓值達(dá)到19.8mmHg；中劑量組下降值達(dá)24.5mmHg；高劑量組SHR收縮壓下降值達(dá)17.1mmHg。中、低劑量組顯現(xiàn)出更好的降壓效果。

表2 連續(xù)灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產(chǎn)物對 SHR收縮壓的影響(±s)Table 2 Effect of swine collagen hydrolysates administrated for 30 days on the systolic pressure of spontaneous hypertension rats (±s)mmHg

表2 連續(xù)灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產(chǎn)物對 SHR收縮壓的影響(±s)Table 2 Effect of swine collagen hydrolysates administrated for 30 days on the systolic pressure of spontaneous hypertension rats (±s)mmHg

注：#.與同時期陰性對照組(NC)相比，有顯著性差異(P＜0.05)；##.與同時期NC 相比，有極顯著性差異(P＜0.01)；+.與同時期陽性對照組(PC)相比，有顯著性差異(P＜0.05)；++.與同時期PC 相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

組別 灌胃前 灌胃后5d10d15d20d25d30d NC160.5±7.4163.8±10.7 166.0±7.4++ 164.8±6.3++ 170.1±5.9++ 171.0±6.3++ 168.1±7.4 ++L159.9±10.6 148.2±11.9##++ 149.6±10.9 ## 146.9±9.5 ## 141.1±10.3 ## 151.6±8.9 ## 148.3±11.6 ##M157.1±10.6 147.2±10.8##++ 147.1±12.1 ## 147.6±11.0 ## 141.4±8.8 ## 145.0±10.2 ## 143.6±11.3##H157.5±8.5 152.6±11.9 ##+ 158.6±8.5 157.0±8.3##+ 154.1±4.3 ##+ 158.5±10.9##++ 151.0±8.7##PC162.2±9.5159.2±7.0 154.5±12.1 ## 151.1±9.8## 146.2±10.3 ## 146.6±9.3 ## 143.5±13.8##

2.2.2 連續(xù)灌胃對SHR舒張壓的影響

表3 連續(xù)灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產(chǎn)物對 SHR舒張壓的影響(±s)Table 3 Effect of swine collagen hydrolysates administrated for 30 days on the diastolic pressure of spontaneous hypertension (±s) mmHg

表3 連續(xù)灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產(chǎn)物對 SHR舒張壓的影響(±s)Table 3 Effect of swine collagen hydrolysates administrated for 30 days on the diastolic pressure of spontaneous hypertension (±s) mmHg

組別 灌胃前 灌胃后5d10d15d20d25d30d NC128.6±9.4 132.4±15.8 136.6±9.1+ 140.0±13.5+ 135.2±11.7++ 136.8±11.5+ 140.8±12.1++ L126.3±14.2 124.0±10.6 #++ 128.7±14.3 122.4±12.1##++ 122.0±13.7 ## 127.8±11.8 # 125.1±12.3 ##M125.5±16.2 121.6±13.3##++ 125.2±10.9 ## 123.7±10.4##+ 119.3±9.9 ## 127.0±11.9 # 121.8±14.7 ##H125.5±10.4 125.4±11.2+ 132.3±14.1 130.1±10.5 ## 128.2±11.6 # 130.3±23.4 # 127.6±9.6 ##PC 125.1±14.0 134.4±9.5 129.9±15.1 131.9±12.4 # 125.2±14.0 ## 126.4±8.0 # 121.5±15.0 ##

由表3可知，與同時段陽性對照組比較，除個別時段外，各劑量組舒張壓總體上無顯著差異。與同時段陰性對照組比較，低、中、高劑量組SHR舒張壓總體上均出現(xiàn)極顯著降低。其中低劑量組在30d時降壓值達(dá)到15.7mmHg；中劑量組下降值達(dá)19.0mmHg；高劑量組下降值達(dá)13.2mmHg。中、低劑量組顯現(xiàn)出更好的降壓效果。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)已研究出多種中藥提取物或食源性多肽具有較好的降壓效果，如楊浩等[11]研究發(fā)現(xiàn)按照1600mg/(kg·d)茶皂苷高劑量連續(xù)灌胃SHR，第4周收縮壓平均值下降18.67mmHg；黃開珍等[12]研究發(fā)現(xiàn)只有按照2g/(kg·d)白子菜水提物的高劑量連續(xù)灌胃SHR，才有顯著的降壓效果，第5周收縮壓平均值下降18.0mmHg，舒張壓下降7.4mmHg；王進(jìn)等[13]考察了玉米大豆復(fù)合肽對SHR的降血壓作用，50mg/kg劑量玉米大豆復(fù)合肽一次性給藥后降血壓作用可一直持續(xù)3h，長期實驗中，SHR血壓顯著降低24.58mmHg；李利生等[14]研究發(fā)現(xiàn)按照500mg/(kg·d)杜仲降壓片劑量連續(xù)灌胃SHR，第4周收縮壓平均值下降29.0mmHg，舒張壓下降32.5mmHg。本實驗豬股骨頭膠原蛋白水解產(chǎn)物的灌胃量30mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃30d SHR收縮壓下降19.8mmHg，舒張壓下降15.7mmHg；50mg/(kg·d)連續(xù)灌胃30d SHR收縮壓下降24.5mmHg，舒張壓下降19.0mmHg。通過與以上植物型原材料制備的降血壓產(chǎn)品對比，豬股骨頭膠原蛋白水解產(chǎn)物的灌胃量更小，且具有更好的長期降壓效果，選用豬股骨頭膠原蛋白作為原材料制備降血壓產(chǎn)品更好。

Jung等[15]用α-胰凝乳蛋白酶水解黃鰭仙魚骨蛋白，在低于5000D的組分中分離出包含了11個氨基酸ACE抑制肽，能顯著降低SHR血壓；Lee等[16]用胃蛋白酶水解鮪魚骨蛋白質(zhì)，得到5000D以下的肽段ACE抑制活性最高，并且能夠顯著降低SHR收縮壓；王金玲等[17]以酸性蛋白酶水解帶魚脊骨，超濾制備得到分子質(zhì)量小于3000D的降血壓肽長期飼喂低劑量組(10mg/(kg·d))使SHR血壓下降15mmHg，高劑量組(50mg/(kg·d))組對SHR降壓幅度達(dá)到20mmHg，并且降壓效果穩(wěn)定。通過對比，豬股骨頭膠原蛋白水解物的降壓效果略優(yōu)于魚骨蛋白水解產(chǎn)物；同時豬骨產(chǎn)量大、易得，因此利用豬骨開發(fā)降血壓產(chǎn)品具有及其廣闊的開發(fā)前景。

豬股骨頭膠原蛋白水解產(chǎn)物能長期穩(wěn)定地降低SHR血壓；在30～70mg/(kg·d)劑量范圍內(nèi)，中、低劑量具有更好的降壓效果。

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