樊冰心，任國(guó)銳，李瑞金，王 蘭,*

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程研究中心，山西 太原 030006)

鎘可以通過(guò)食物鏈傳遞進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧自由基而形成氧脅迫，使機(jī)體抗氧化體制失衡，進(jìn)而對(duì)機(jī)體造成損傷[1-2]。急性或慢性鎘的作用會(huì)對(duì)動(dòng)物器官尤其是肝臟產(chǎn)生明顯損傷或危害。低分子質(zhì)量殼聚糖(low molecular weight chitosan，LMWC)具有非常好的抗氧化、提高免疫、促生長(zhǎng)和保護(hù)肝臟等諸多功能[3-5]。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)，LMWC可以有效清除華溪蟹體內(nèi)的自由基，提高其非特異性免疫，降低機(jī)體內(nèi)氧化損傷程度[6]。近年來(lái)，LMWC抗氧化功能的研究越來(lái)越受到研究者的重視。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)就LMWC和鎘獨(dú)立及共同作用下河南華溪蟹肝胰腺組織中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)活性、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量以及鎘積累的變化規(guī)律進(jìn)行研究，旨在探討LMWC對(duì)鎘引起氧化損傷的防護(hù)機(jī)制，為更好地利用殼聚糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河南華溪蟹，于2011年9月購(gòu)自太原市五龍口水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，置實(shí)驗(yàn)室水族缸(45cm×30cm×30cm)暫養(yǎng)2周以上后待用。養(yǎng)殖所用水為曝氣48h的自來(lái)水，水溫16～20℃，pH7.5，溶氧量8.0～8.3mg/L。每日換水1次，并及時(shí)清理缸內(nèi)排泄物，每周投喂飼料3次。

低分子質(zhì)量殼聚糖(≤5000D，灰分0.87%，細(xì)度80目) 浙江金殼甲殼生物公司；MDA、SOD、GSH和GST試劑盒 南京建成生物工程有限公司；氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)分子儀器公司；Varian AA 240FS火焰原子吸收儀 美國(guó)安捷倫公司；MR 23低溫冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；MM-49647-00電動(dòng)勻漿器 德國(guó)Fluko公司；XW-80A漩渦混合器 上海棱譜儀器儀表有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；CPA225D電子天平 德國(guó)賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)鎘對(duì)河南華溪蟹的急性毒性實(shí)驗(yàn)，由概率單位法求得96h時(shí)LC50為232.00mg/L[7]。根據(jù)LC50的12.5%、25%和37.5%實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)鎘處理組(A、B、C組)：29、58、87mg/L，3個(gè)LMWC組(D、E、F組)：20、40、80mg/L，鎘(58mg/L)與3個(gè)不同質(zhì)量濃度(20、40、80mg/L)LMWC聯(lián)合作用組(G、H、I組)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)平行，處理時(shí)間96h。

隨機(jī)選取60只健康、靈敏且體質(zhì)量基本一致的河南華溪蟹個(gè)體(體質(zhì)量(20.0±0.5)g)隨機(jī)分成10組，置處理缸(45cm×30cm×30cm)中，每缸加2L曝氣48h的自來(lái)水。鎘處理組：首先將氯化鎘配制成母液，再稀釋至各實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度；LMWC組：根據(jù)不同質(zhì)量濃度加入不同量的LMWC；鎘和LMWC聯(lián)合作用組：加入一定體積的氯化鎘母液和不同量的LMWC。處理期間不喂食。

1.3.2 樣品制備

將蟹體放在冰盤上活體解剖，迅速取出肝胰腺組織，其中一部分用于測(cè)定SOD、MDA、GST和GSH。具體方法：稱質(zhì)量后按1：10(m/V)加入預(yù)冷的生理鹽水，電動(dòng)勻漿器勻漿(冰上操作)，將勻漿液4℃、4000r/min條件下離心15min，取上清液，－80℃冷凍備用；另一部分用于測(cè)定鎘積累量，具體方法：在肝胰腺組織中加入混合酸液(高氯酸與濃硫酸的體積比為1：3)過(guò)夜，置電熱板上，120℃消化4h左右，至棕色氣體消失，得到透明溶液。如消化過(guò)程樣品發(fā)生炭化則需補(bǔ)加相同比例的混酸，冷卻后消化得到透明溶液用超純水定容至10mL。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

SOD、GST活性及GSH、MDA含量和蛋白質(zhì)水平采用南京建成生物工程有限公司試劑盒說(shuō)明進(jìn)行具體操作，鎘積累量用火焰原子吸收儀測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘單獨(dú)處理和LMWC與鎘聯(lián)合作用對(duì)河南華溪蟹肝胰腺組織鎘積累的影響

圖 1 鎘單獨(dú)處理和LMWC與鎘聯(lián)合處理96h鎘在河南華溪蟹肝胰腺組織中的積累Fig.1 Accumulation of Cd2+ in hepatopancreas of S. henanense exposed to Cd2+ alone or to both LMWC and Cd2+ for 96 h

由圖1可知，鎘在河南華溪蟹肝胰腺組織中的積累隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸升高，且3個(gè)劑量組與對(duì)照組相比均表現(xiàn)出顯著或極顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)；與58mg/L鎘組相比，鎘積累隨著LMWC濃度的升高逐漸降低，且在80mg/L時(shí)表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 鎘或LMWC作用下河南華溪蟹肝胰腺組織SOD活性的變化

圖 2 鎘或LMWC處理96h SOD活性在河南華溪蟹肝胰腺組織中的變化Fig.2 SOD activity in hepatopancreas of S. henanense exposed to Cd2+or LMWC for 96 h

由圖2可知，與對(duì)照組相比，用鎘染毒96h，河南華溪蟹肝胰腺組織SOD活性顯著下降，呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。但是，LMWC對(duì)SOD活性的變化并未表現(xiàn)出顯著性差異。

2.3 鎘或LMWC作用下河南華溪蟹肝胰腺組織MDA含量的變化

圖 3 鎘或LMWC處理96h MDA含量在河南華溪蟹肝胰腺組織中的變化Fig.3 MDA content in hepatopancreas of S. henanense exposed to Cd2+or LMWC for 96 h

由圖3可知，與對(duì)照組相比，鎘處理組的河南華溪蟹肝胰腺組織MDA含量顯著增加，呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。但是，LMWC對(duì)MDA含量的變化并未表現(xiàn)出顯著性差異。

2.4 鎘單獨(dú)處理和LMWC與鎘聯(lián)合作用對(duì)河南華溪蟹肝胰腺組織GSH含量的影響

圖 4 鎘單獨(dú)處理和LMWC與鎘聯(lián)合處理96h GSH含量在河南華溪蟹肝胰腺組織中的變化Fig.4 GSH content in hepatopancreas of S. henanense exposed to Cd2+alone or to both LMWC and Cd2+ for 96 h

由圖4可知，GSH在河南華溪蟹肝胰腺組織中的含量隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸降低，且3個(gè)質(zhì)量濃度組與對(duì)照組表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05)；與58mg/L鎘組相比，GSH含量隨著LMWC質(zhì)量濃度的升高逐漸升高，且在80mg/L時(shí)表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05)。

2.5 鎘單獨(dú)處理和LMWC與鎘聯(lián)合作用對(duì)河南華溪蟹肝胰腺組織GST活性的影響

圖 5 鎘單獨(dú)處理和LMWC與鎘聯(lián)合處理96h GST活性在河南華溪蟹肝胰腺組織中的變化Fig.5 GST activity in hepatopancreas of S. henanense exposed to Cd2+alone or to both LMWC and Cd2+ for 96 h

由圖5可知，GST在河南華溪蟹肝胰腺組織中的活性隨著染毒質(zhì)量濃度的增加逐漸降低，且在58mg/L和87mg/L時(shí)相對(duì)于對(duì)照組表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05)；與58mg/L鎘組相比，GST活性隨著LMWC質(zhì)量濃度的升高逐漸升高，且在80mg/L時(shí)表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05)。

3 討 論

3.1 鎘在河南華溪蟹肝胰腺組織的積累及其脂質(zhì)過(guò)氧化作用

肝胰腺組織是甲殼動(dòng)物重要的解毒器官，在消除外來(lái)有毒物質(zhì)對(duì)生物機(jī)體毒害影響方面起著重要作用，同時(shí)它也是主要的消化器官，是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和貯存的主要場(chǎng)所，生理代謝活動(dòng)的中心，更是重金屬積累的主要器官[8]。自由基介導(dǎo)的生物體內(nèi)的氧化損傷是重金屬毒性效應(yīng)的重要體現(xiàn)，脂質(zhì)過(guò)氧化是這種氧化損傷的一種主要形式[9]。SOD是一種以自由基為底物的抗氧化酶，能有效清除超氧陰離子自由基，是生物體內(nèi)防御氧化損傷的一種非常重要的金屬酶。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，能夠很好地反應(yīng)生物體過(guò)氧化脅迫的程度。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鎘處理后，河南華溪蟹肝胰腺組織中鎘的積累量隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增加，58mg/L鎘引起SOD活性顯著下降，MDA含量顯著上升，提示鎘不僅能在溪蟹肝胰腺組織內(nèi)積累，并可引起脂質(zhì)過(guò)氧化。

3.2 低分子質(zhì)量殼聚糖對(duì)鎘脅迫下河南華溪蟹肝胰腺組織的保護(hù)作用

LMWC具有純天然活性及無(wú)毒副作用，有研究報(bào)道LMWC用于水產(chǎn)養(yǎng)殖可以促進(jìn)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖起到保護(hù)作用[10-11]。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)LMWC與鎘聯(lián)合作用可以使華溪蟹肝胰腺組織SOD活性升高和MDA含量降低[12]，LMWC能提高鎘脅迫下機(jī)體的抗氧化能力。本研究結(jié)果表明，在LMWC單獨(dú)作用下沒有引起SOD活性和MDA含量的顯著變化，說(shuō)明LMWC單獨(dú)作用不會(huì)引起河南華溪蟹肝胰腺組織脂質(zhì)過(guò)氧化，不會(huì)對(duì)華溪蟹的生長(zhǎng)帶來(lái)負(fù)面影響。同時(shí)，在鎘處理下肝胰腺組織中鎘的積累量隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增加，但是，在80mg/L LMWC和鎘的聯(lián)合作用下，鎘的積累量顯著下降。LMWC引起鎘在肝胰腺組織積累量下降的原因可能是：1)LMWC是自然界中唯一的一種堿性多糖，水溶性好，其本身具有較多的活性基團(tuán)(氨基、羥基)，這些活性基團(tuán)可以與重金屬有效結(jié)合起到去除重金屬的作用和良好的解毒作用[13-15]，大量的鎘在華溪蟹體外被絡(luò)和，進(jìn)入體內(nèi)的量會(huì)減少，鎘在機(jī)體內(nèi)的積累和毒性明顯降低。2)LMWC對(duì)肝胰腺組織的保護(hù)作用。通常，當(dāng)外來(lái)毒物對(duì)華溪蟹造成脅迫時(shí)，肝胰腺組織自身有一定的解毒作用。GSH屬于含有巰基的、小分子肽類物質(zhì)，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽。GSH作為一種解毒物質(zhì)，通常在肝胰腺組織中含量最高[16]。GSH對(duì)機(jī)體中活性氧自由基的清除起著重要的作用，GSH含量的變化可以靈敏地反映機(jī)體解毒能力強(qiáng)弱[17]。GSH中半胱氨酸上的巰基為活性基團(tuán)可以和重金屬絡(luò)合，以巰基-鎘的形式將鎘排出體外，從而起到解毒的作用；同時(shí)GSH作為體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，其本身也極易被氧化，可起到保護(hù)蛋白質(zhì)和酶等分子中巰基不被自由基等毒物氧化，從而使蛋白質(zhì)和酶發(fā)揮其本來(lái)的功能[18]。GST廣泛存在各種生物組織中，是一種小分子的水溶性蛋白，在機(jī)體受到氧化損傷后起著重要的作用[19]。GST可以催化體內(nèi)的或者外來(lái)入侵的有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與GSH中的巰基結(jié)合，增強(qiáng)有害物質(zhì)的疏水性，且易于機(jī)體生理排泄，從而達(dá)到解毒的目的[20]；此外，GST也可以通過(guò)修復(fù)自由基引起的細(xì)胞膜磷脂損傷來(lái)抑制氧化反應(yīng)的發(fā)生，從而發(fā)揮其抗氧化作用[21]。GSH水平和GST活性的下降，意味著組織解毒能力下降?？梢姰?dāng)外界有毒物質(zhì)大量入侵時(shí)，GSH含量的多少和GST活性的高低對(duì)機(jī)體的解毒能力和抗氧化能力起到非常重要的作用。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，鎘、鉛、銅作用于水生動(dòng)物，隨著重金屬質(zhì)量濃度的增大GSH含量和GST活性明顯降低[21-23]。本研究表明，鎘脅迫下使華溪蟹肝胰腺組織中GSH含量和GST活性顯著下降，說(shuō)明有大量毒物侵害時(shí)，華溪蟹肝胰腺組織本身的解毒作用已經(jīng)不能達(dá)到明顯的效果。而加入LMWC后，GSH含量和GST活性顯著升高，在80mg/L LMWC與鎘聯(lián)合作用時(shí)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LMWC具有非常好的抗氧化活性，短鏈殼聚糖分子中的活性官能團(tuán)更容易暴露出來(lái)，不僅有利于清除氧自由基，發(fā)揮其抗氧化能力[24]，還能通過(guò)提高GSH和GST水平，增強(qiáng)機(jī)體的解毒能力，減少鎘引起的氧化脅迫效應(yīng)，對(duì)華溪蟹肝胰腺組織有積極的保護(hù)作用。

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