賈靜靜，史 鋒,*，王利平，王小元

(1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種革蘭氏陽性致病菌，也是一種主要的食源性致病菌，在臨床上能夠引發(fā)心內膜炎、骨髓炎、肺炎等疾病[1]；在食品加工過程中，易傳播，導致食物中毒[2]。據美國疾控中心報道，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒位居第2位，占整個細菌性食物中毒病例的33%，加拿大則高達45%。中國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多[3]。2008年4月3日，維維大亨高鈣奶粉因污染金黃色葡萄球菌而導致百名兒童中毒[4]?？刂平瘘S色葡萄球菌的方法有物理法、化學法[5]，然而這些方法都不盡理想，而且金黃色葡萄球菌對抗生素的耐藥性越來越強[6]。因此，近年來利用特異性噬菌體控制金黃色葡萄球菌越來越受到研究者的關注。

當噬菌體侵入金黃色葡萄球菌時，為了吸附到細胞上，會選擇細胞表面的一種成分作為其吸附的受體[7]，如磷壁酸、糖蛋白或者肽聚糖[8]。一種噬菌體的宿主范圍取決于它與宿主細胞表面受體之間的特異性吸附能力的大小。而吸附位點的特異性和吸附能力大小也影響著噬菌體對其宿主菌污染或感染的抑制效果。因此確定一種噬菌體與宿主菌相互作用時的吸附位點顯得尤為重要。對于大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的噬菌體來說，其吸附的受體已被詳細地報道[9]。例如：T系列噬菌體對大腸桿菌B菌株的吸附位點為細胞外膜蛋白OmpA[10]；λ系列噬菌體對大腸桿菌K12的吸附位點為細胞表面LamB蛋白等[11]。然而有關革蘭氏陽性菌噬菌體的吸附位點的報道則比較少。1969年，Chatterjee[12]研究發(fā)現當金黃色葡萄球菌的磷壁酸結構中缺乏N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)時，會對噬菌體產生抗性。Hill[13]的研究表明編碼乳酸菌細胞表面上噬菌體受體的基因發(fā)生了點突變，使受體結構發(fā)生變化，會對噬菌體產生抗性。直到2010年，Rosanna等[1]才確定了噬菌體M吸附金黃色葡萄球菌A170的位點為GlcNAc。受噬菌體侵染后出現的這種對噬菌體具有抗性的菌株被稱為噬菌體不敏感突變株(bacteriophage-insensitive mutant，BIM)。BIM菌株的出現一方面降低了噬菌體對宿主菌的裂解能力，會對病原菌的控制效果產生不利影響；另一方面可以大幅降低突變菌株的毒力，并保留其免疫原性，因此有望被開發(fā)成減毒疫苗而具有有利的應用前景。

本實驗室從環(huán)境中篩選到的噬菌體JS01裂解金黃色葡萄球菌ATCC25923時，產生并分離到了BIM菌株ATCC25923R，并對兩種菌株的菌落形態(tài)、生長狀況以及受噬菌體JS01的裂解情況進行了對比，研究了ATCC25923和ATCC25923R的磷壁酸結構的差異，確定了噬菌體JS01的吸附位點。這對于了解JS01與其宿主菌的相互作用并提高其抗菌性能具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宿主菌金黃色葡萄球菌ATCC25923 中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；金黃色葡萄球菌噬菌體不敏感菌株ATCC25923R以及噬菌體JS01由本實驗室分離；TSB培養(yǎng)基(大豆肉湯培養(yǎng)基) 美國BD公司；蛋白胨、酵母膏 英國Oxoid公司；N-乙酰葡萄糖胺 美國BBI公司；辛基-瓊脂糖凝膠4FF 美國GE Pharmacia公司。

1.2 儀器與設備

THZ-300C型恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科技有限公司；Operation Manual Rotavapor?RII旋轉蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；Trace MS氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國菲尼根公司；Turbo Matrix TD熱脫附進樣器 美國PE公司；DC-12氮吹儀 上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)以及噬菌體的增殖

挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，以1：100的比例轉接至新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。至OD600nm值為1.0后按一定的比例加入噬菌體，37℃振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液澄清，離心，取上清液，用0.22μm水相微孔濾膜過濾后，保存在4℃冰箱中，以備使用。

1.3.2 噬菌體不敏感菌株的分離

金黃色葡萄球菌ATCC25923搖床培養(yǎng)至OD600nm值為1.0后，以MOI (即噬菌體數/初始細菌數)為0.1的比例加入噬菌體，6h后取出100μL培養(yǎng)液，10倍梯度稀釋，取100μL涂布，37℃條件下培養(yǎng)24h，單菌落劃線純化3～5代后，得到的菌落即為噬菌體不敏感菌株，記作ATCC25923R，保存。觀察得到的BIM菌株的菌落形態(tài)，測定其生長狀況，以及噬菌體對其裂解狀況。

1.3.3 金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC25923R磷壁酸的提取與結構分析

磷壁酸的提取參照Andreas等[14]提到的方法。得到的磷壁酸粉末1mg加入3mL 2mol/L三氟乙酸(TFA)溶解，封口，120℃烘箱中水解反應2h，取出，減壓蒸干，加甲醇蒸干3次，重復操作以完全除盡TFA。水解后殘余物加入100mg NaBH4和2mL水，室溫條件下放置過夜進行還原反應。加入冰醋酸以除去過量的NaBH4，再于旋轉蒸發(fā)儀上濃縮樣品至黏稠狀態(tài)，加入3～5mL甲醇-冰醋酸(5：1，V/V)，蒸干3次，繼續(xù)用甲醇蒸干2次，得到白色粉末，放入105℃烘箱加熱15min以除去水分。然后加入3mL乙酸酐，于101℃烘箱中乙酰化反應1h，取出，多次加甲苯于50℃水浴減壓共沸蒸干至粉末狀。最后加適量水溶解粉末狀樣品，用氯仿萃取3次，合并氯仿層，水洗3次，分出氯仿層濃縮后進行氣相色譜-質譜分析。氣相色譜-質譜分析時，色譜柱為PB-5毛細管柱；程序升溫：150℃保持1min，以10℃/min升至280℃，保持6min；載氣(H2)流速0.8mL/min，進樣量10μL；質量掃描范圍m/z 35～400。

1.3.4 不同化合物對噬菌體裂解的影響

過夜培養(yǎng)金黃色葡萄球菌ATCC25923，以1：100的接種量轉接至20mL含有不同化合物的TSB培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm值為1.0，按MOI為0.1的比例加入噬菌體JS01，1h后測定培養(yǎng)液的OD600nm值。所測試的化合物包括0、5、10、20mmol/L的葡萄糖、GlcNAc，0μg/L和8μg/L的金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC25923R磷壁酸(提取見1.3.3節(jié))。

2 結果與分析

2.1 噬菌體不敏感菌株的分離

噬菌體JS01裂解金黃色葡萄球菌ATCC25923的過程中，在裂解的初期，培養(yǎng)液中的活菌數會急速下降，隨著裂解時間的延長，菌體濃度上升(圖1A)，產生了噬菌體不敏感菌株(BIM)。于是從裂解后期的裂解液中分離出1株BIM菌株ATCC25923R(圖1C)。

圖 1 金黃色葡萄球菌ATCC25923噬菌體不敏感菌株的分離 Fig.1 Isolation of bacteriophage-insensitive mutant strain of S. aureus ATCC25923

2.2 金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC25923R的生長性能與噬菌體裂解性能

圖 2 ATCC25923R與ATCC25923菌株性質對比Fig.2 Comparison between ATCC25923R and ATCC25923 strains

ATCC25923和ATCC25923R的生長曲線顯示，兩種菌株的生長基本一致，都是在12h后達到穩(wěn)定期(圖2A)。而從菌落形態(tài)上觀察，ATCC25923R(圖1C)比ATCC25923的菌落(圖1B)更大，邊緣光滑濕潤，顏色更深。噬菌體JS01對兩者的裂解能力也不同，將噬菌體JS01加入ATCC25923R的過夜培養(yǎng)液以后，菌體濃度(OD600nm值)繼續(xù)上升，ATCC25923R不能被噬菌體所裂解，而將JS01加入ATCC25923培養(yǎng)液后，OD600nm值會急速下降至0.278(圖2B)，菌液變澄清(圖2C)。說明噬菌體不敏感突變株ATCC25923R與出發(fā)菌ATCC25923相比，菌株發(fā)生了變化，因此進一步分析金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC25923R表面的磷壁酸結構。

2.3 金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC25923R表面的磷壁酸結構差異

圖 3 ATCC25923R與ATCC25923磷壁酸的GC-MS圖譜Fig.3 GC-MS analysis of teichoic acid

從金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC25923R中提取磷壁酸，用GC-MS分析了兩菌株磷壁酸結構的差異。GC-MS圖譜顯示(圖3)，ATCC25923R與ATCC25923的磷壁酸結構中糖組分的主體衍生化物質為六?；?D-葡萄糖醇，對應的出峰時間為13.88min，敏感菌ATCC25923中此成分的比例明顯高于非敏感菌。而在ATCC25923R菌株的磷壁酸結構中，還多出一種物質五酰基-戊糖醇，其出峰時間為11.03min，說明兩者的磷壁酸結構存在著差異。

2.4 噬菌體的吸附位點分析

金黃色葡萄球菌ATCC25923R的菌落形態(tài)以及對噬菌體的敏感性與ATCC25923相比，發(fā)生了很大的變化，說明當噬菌體吸附細菌時，細胞表面組成成分發(fā)生了變化，那么哪個成分可以作為噬菌體的受體？對此進行了深一步的研究。

在ATCC25923對數期培養(yǎng)液中加入噬菌體JS01后，經過1h，菌液變澄清，OD600nm值由1.0急速下降至0.278；而未加噬菌體的培養(yǎng)液OD600nm值則從1.0繼續(xù)增加至1.780(圖4)，說明噬菌體對ATCC25923有很好的控制效果。當ATCC25923的培養(yǎng)液中含有20mmol/L GlcNAc時，加入噬菌體JS01作用1h后培養(yǎng)液的OD600nm值從1.0略降至0.695，明顯高于不含GlcNAc的對照(OD600nm=0.278)。說明由于GlcNAc的存在，一部分ATCC25923逃避了噬菌體JS01的吸附和裂解，即一部分噬菌體與GlcNAc這一底物相結合，而沒有與宿主菌表面受體相吸附，從而裂解金黃色葡萄球菌ATCC25923。隨著GlcNAc濃度的降低，培養(yǎng)液的OD600nm值相對于沒有加入GlcNAc的對照組的增加幅度不斷減少。說明GlcNAc參與噬菌體的吸附，因此它是噬菌體JS01裂解ATCC25923時的吸附位點。

圖 4 GlcNAc存在時噬菌體JS01對ATCC25923的裂解作用Fig.4 Lysis of ATCC25923 by phage JS01 in the presence of GlcNAc

在ATCC25923的培養(yǎng)液中添加20、10mmol/L或者5mmol/L葡萄糖時，JS01作用1h后培養(yǎng)液的OD600nm值分別降低0.276、0.256和0.284，與不含培養(yǎng)液的對照組(OD600nm=0.278)相接近(圖5)，即葡萄糖對噬菌體的裂解作用沒有任何影響，說明葡萄糖在噬菌體與宿主菌相互吸附的過程中沒有參與宿主菌的競爭，也沒有加強噬菌體的裂解效果，因此葡萄糖不是噬菌體的吸附位點。

圖 5 葡萄糖存在時噬菌體JS01對ATCC25923的裂解作用Fig.5 Lysis of ATCC25923 by phage JS01 in the presence of glucose

最后本實驗又測試了提取的A T C C 2 5 9 2 3 和ATCC25923R的磷壁酸對噬菌體JS01裂解效果的影響。當培養(yǎng)基中添加8μg/L的ATCC25923或ATCC25923R的磷壁酸時，噬菌體作用1h后培養(yǎng)液的OD600nm值分別降低到0.276、0.302，與不含培養(yǎng)液的對照組(OD600nm=0.278)相接近(圖6)，而且不管是加入從ATCC25923菌株還是從ATCC25923R菌株提取出來的磷壁酸都沒有差異，說明細菌磷壁酸結構的變化并沒有影響噬菌體對它的吸附作用，突變菌株的磷壁酸結構中的主導成分沒有發(fā)生變化，同時也說明整個磷壁酸結構不是噬菌體吸附ATCC25923的位點。

圖 6 磷壁酸存在時噬菌體JS01對ATCC25923的裂解作用 Fig.6 Lysis of ATCC25923 by phage JS01 in the presence of teichoic acid from ATCC25923 and ATCC25923R

3 討 論

金黃色葡萄球菌是一種食源性病源菌，利用特異性噬菌體控制金黃色葡萄球菌的污染和感染已成為食品安全領域和醫(yī)學領域研究的趨勢與重點。本實驗中的噬菌體JS01能夠快速有效地殺死金黃色葡萄球菌ATCC25923。然而，這種控制作用隨著時間的延長而效果減弱，ATCC25923發(fā)生突變，產生了噬菌體不敏感菌株ATCC25923R。突變菌株的菌落相比于出發(fā)菌株形態(tài)更大，顏色更深，同時對噬菌體JS01產生了抗性。據文獻報道，菌株對噬菌體產生抗性的原因有很多，例如：1)在噬菌體吸附時，金黃色葡萄球菌表面會形成一種蛋白質A，這種蛋白質與免疫球蛋白G結合，掩蓋噬菌體的吸附位點，而阻礙噬菌體的吸附[15]；2)噬菌體對莢膜包裹的金黃色葡萄球菌的裂解效果比對無莢膜的菌株明顯減弱，莢膜作為一種阻礙物阻止噬菌體與宿主菌表面吸附位點的結合[16]；3)一些二價陽離子如Ca2+、Mg2+能夠影響細菌表面所攜帶的靜電荷，從而影響噬菌體與細菌之間的碰撞而促進噬菌體的吸附[17]等。本研究對敏感菌株ATCC25923和不敏感菌株ATCC25923R磷壁酸結構的分析顯示，不敏感菌株的磷壁酸結構發(fā)生了變化，這可能是導致兩者對JS01敏感性差異的一個原因，這還有待于進一步的實驗證實。

一般來說，細菌是在紫外照射或噬菌體裂解時間延長時發(fā)生突變，產生噬菌體不敏感菌株BIM。但這種突變呈現一定的不穩(wěn)定性，有時突變細胞經過多次的純化后，可以恢復對噬菌體的敏感性，因此不影響噬菌體作為一種醫(yī)療佐劑或者食品保護劑的抗菌效果[18]。鑒于噬菌體對人體的無毒性、安全性和可食性，使得它在治療病原菌感染和控制食源病菌的污染方面具有積極的應用價值。而且最近的研究表明BIM菌株還有其他有益的用途。如在一個金黃色葡萄球菌BIM菌株A172中，13個與毒素有關的編碼基因的轉錄與表達水平大幅度下降，致使菌株毒力降低。A172還能調節(jié)小鼠體內TNF-α、IFN-γ、IL-1β基因的轉錄。更為重要的是，A172能夠有效地保護小鼠，免于受致死劑量的毒性菌株A170感染，因此提示出BIM菌株在免疫上的廣闊應用前景[1]。

噬菌體吸附金黃色葡萄球菌時，其吸附位點可能是磷壁酸、肽聚糖或者糖蛋白。在本實驗中，考察了當葡萄糖、GlcNAc、磷壁酸存在時，噬菌體JS01對金黃色葡萄球菌ATCC25923裂解效果的變化。結果發(fā)現，只有當培養(yǎng)基中含有GlcNAc時，噬菌體裂解ATCC25923的效率才會下降，而且隨著GlcNAc濃度的提高，裂解效率下降程度增大；當培養(yǎng)基中含有葡萄糖時，裂解效率與對照組保持一致；在培養(yǎng)基中加入ATCC25923和ATCC25923R菌株的磷壁酸時，裂解效率不變，表明只有GlcNAc是噬菌體JS01的吸附位點。這些研究為揭示噬菌體JS01的裂解機制和受體位點及其應用奠定了基礎。

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