田 野，歐仕益*

(暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632)

多酚類物質(zhì)廣泛存在于植物的根、皮、木、葉和果內(nèi)，且含量豐富，在許多針葉樹皮中的含量高達20%～40%，僅次于纖維素、木質(zhì)素和半纖維素。此外，植物多酚具有許多活潑位點賦予它一系列獨特的化學性質(zhì)，其中植物多酚與蛋白質(zhì)的結(jié)合是其最重要的特性之一[1]。

纖維素酶和木聚糖酶均屬于高度專一的水解生物催化劑，在水解纖維質(zhì)時起協(xié)同作用[2-4]。纖維素酶與木聚糖酶已廣泛應用于食品工業(yè)中，如水解纖維多糖獲得單糖和低聚糖、增加細胞壁的通透性從而提高細胞內(nèi)含物(如蛋白質(zhì)、淀粉、油脂、糖等)的提取率、簡化食品加工工藝等[5-7]。但食品原料中豐富的多酚類物質(zhì)對酶的影響限制了酶解效率。因此，研究多酚與酶的相互作用對食品工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

單寧又稱鞣質(zhì)，是植物的主要多酚類物質(zhì)，按其化學結(jié)構(gòu)可分為水解單寧和縮合單寧兩大基本類型[8-9]。本實驗在多酚中選擇單寧酸，將其按不同質(zhì)量濃度分別添加到酶反應體系中，研究單寧酸對纖維素酶和木聚糖酶的影響，從而為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

纖維素酶(1400U/mg)、木聚糖 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；濾紙 杭州特種紙業(yè)有限公司；木聚糖酶(2500FXU(W)/g) 諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；單寧酸 天津市福晨化學試劑廠；3,5-二硝基水楊酸 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

SHA-B水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；HH-4恒溫水浴鍋 江蘇金壇市宏華儀器廠；KDC-1044低速離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；紫外-可見分光光度計、熒光光譜儀 美國Perkin Elmer儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 單寧酸對酶活力的影響

1.3.1.1 單寧酸對纖維素酶活力的影響

將濾紙剪成紙片(1cm×1cm)烘干后作為酶解底物。用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0)配制質(zhì)量濃度為10mg/mL的纖維素酶液和0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的單寧酸溶液。取100mL三角瓶，各加入1g濾紙片、10mL單寧酸溶液和20mL酶液，在50℃的恒溫振蕩器振蕩(100r/min)反應3h后，置于沸水浴中15min終止酶促反應。離心，取1mL上清液，用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定還原糖，各處理重復3次[10]。

1.3.1.2 單寧酸對木聚糖酶活力的影響

用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)分別配制質(zhì)量濃度為2mg/mL的木聚糖酶液和5mg/mL的木聚糖液，以及質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/mL的單寧酸溶液。按1.3.1.1節(jié)方法設置酶促反應體系，反應結(jié)束后測定還原糖，各處理重復3次。

1.3.2 單寧酸影響酶活性的動力學研究

1.3.2.1 單寧酸影響纖維素酶活性的動力學研究

用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0)配制質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10mg/mL的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液、4mg/mL的纖維素酶液及2.5mg/mL的單寧酸溶液。取5支10mL試管分別加入2mL纖維素酶液，在50℃水浴中孵育10min后，再依次加入2mL單寧酸溶液和4mL不同質(zhì)量濃度的CMC-Na溶液，繼續(xù)孵育5min。立即置于沸水浴中滅活。離心，取2mL上清液用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定還原糖，各處理重復3次。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法制得酶動力學曲線，并計算Km和Vmax值。

1.3.2.2 單寧酸影響木聚糖酶活性的動力學研究

分別配制質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10mg/mL的木聚糖液，2.5mg/mL的單寧酸以及4mg/mL的木聚糖酶液(0.1mol/L、pH5.5醋酸-醋酸鈉緩沖液配制)，按1.3.2.1節(jié)方法進行實驗。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法制得酶動力學曲線，并計算Km和Vmax值。

1.3.3 單寧酸對酶紫外差示光譜的影響

1.3.3.1 單寧酸對纖維素酶紫外差示光譜的影響

用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0)配制質(zhì)量濃度為4.7mg/mL纖維素酶液和質(zhì)量濃度為0.4、0.9、1.8、3.5mg/mL的單寧酸溶液。取50mL三角瓶，各加入30mL纖維素酶液，5mL單寧酸溶液，混合，放置15min后，利用紫外-可見分光光度計在220～320nm波長范圍內(nèi)掃描，以緩沖溶液代替酶液作對照。各處理重復3次，記錄其紫外差示光譜。

1.3.3.2 單寧酸對木聚糖酶紫外光譜的影響

用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)配制質(zhì)量濃度為4.7mg/mL木聚糖酶液和0.4、0.9、1.8、3.5mg/mL的單寧酸溶液。按上述方法繪制其紫外差示光譜。

1.3.4 單寧酸對酶熒光光譜的影響

1.3.4.1 單寧酸對纖維素酶熒光光譜的影響

用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0)配制質(zhì)量濃度為4.7mg/mL纖維素酶液和0.9、1.8、3.5、7mg/mL的單寧酸溶液。取50mL三角瓶，各加入30mL纖維素酶液、5mL單寧酸溶液，混勻，放置15min后，分別在λEX=278nm和λEX=295nm波長處掃描300～400nm的熒光淬滅光譜；以緩沖溶液代替酶液作對照。各處理重復3次，記錄其熒光光譜。

1.3.4.2 單寧酸對木聚糖酶熒光光譜的影響

用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)配制質(zhì)量濃度為4.7mg/mL木聚糖酶液和0.4、0.9、1.8、3.5mg/mL的單寧酸溶液。按上述方法掃描300～400nm的熒光淬滅光譜，各處理重復3次，記錄其熒光光譜。

1.3.5 單寧酸的測定

單寧酸吸光度=A1－A2

式中：A1為單寧酸與酶反應的吸光度；A2為緩沖液中相同質(zhì)量濃度單寧酸的吸光度。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酸對酶活力的影響

圖 1 不同質(zhì)量濃度單寧酸對纖維素酶(a)和木聚糖酶(b)釋放還原糖的影響(n=3)Fig.1 Effect of different concentrations of tannic acid on the release of reducing sugars by cellulase and xylanase (n=3)

由圖1可知，單寧酸對纖維素酶具有抑制作用。這種抑制作用會隨著單寧酸質(zhì)量濃度的升高而增大。當單寧酸質(zhì)量濃度為1.00mg/mL時，抑制率就達到35.33%。同樣，單寧酸能抑制木聚糖酶的活力。這種抑制作用在單寧酸質(zhì)量濃度為0.50mg/mL時達到最大，此時的抑制率為37.16%。當體系中單寧酸質(zhì)量濃度超過0.50mg/mL時，還原糖質(zhì)量濃度曲線會有所回升并趨于平緩。

2.2 單寧酸影響酶活性的動力學研究

表1 單寧酸對1mg/mL纖維素酶動力學參數(shù)的影響(±s，n=3)Table 1 Effect of different concentrations of tannic acid on kinetics parameters of cellulase(±s，n=3)

表1 單寧酸對1mg/mL纖維素酶動力學參數(shù)的影響(±s，n=3)Table 1 Effect of different concentrations of tannic acid on kinetics parameters of cellulase(±s，n=3)

項目CMC-Na質(zhì)量濃度/(mg/mL)(mg/(mL·min))動力學方程Km/(mg/mL)反應速率/Vmax/(mg/(mL·min))1.000.19±0.01未加酚酸2.000.22±0.00 3.000.23±0.01 4.000.24±0.00 5.000.25±0.00 1/v=1.68×1/S+3.72(R2=0.9928)0.45±0.030.27±0.00 1.000.16±0.00單寧酸2.000.20±0.01 3.000.22±0.00 4.000.23±0.01 5.000.24±0.01 1/v = 2.51 × 1/S + 3.71(R2=0.9959)0.68±0.040.27±0.00

表2 單寧酸對1mg/mL木聚糖酶動力學參數(shù)的影響(±s，n=3)Table 2 Effect of different contractions of tannic acid on kinetics parameters of xylanase(±s，n=3)

表2 單寧酸對1mg/mL木聚糖酶動力學參數(shù)的影響(±s，n=3)Table 2 Effect of different contractions of tannic acid on kinetics parameters of xylanase(±s，n=3)

項目 木聚糖質(zhì)量濃度/(mg/mL)(mg/(mL·min))動力學方程Km/(mg/mL)Vmax/(mg/(mL·min))反應速率/1.000.08±0.00未加酚酸2.000.15±0.00 3.000.21±0.01 4.000.26±0.01 5.000.32±0.01 1/v = 11.99 × 1/S + 0.77(R2=0.9996)15.62±0.30 1.30±0.02 1.000.09±0.00單寧酸2.000.14±0.01 3.000.18±0.01 4.000.22±0.00 5.000.27±0.01 1/v = 9.19 × 1/S + 2.27(R2=0.9869)4.05±0.54 0.44±0.03

如表1、2所示，單寧酸對纖維素酶具有競爭性抑制作用，表現(xiàn)為Km值顯著增大，而最大反應速率基本不變。這表明單寧酸能夠降低纖維素酶對底物的親和力，從而抑制纖維素酶活力。與纖維素酶相比，單寧酸抑制木聚糖酶活力，表現(xiàn)為最大反應速率和Km值均顯著減小，這說明單寧酸既能作用于游離的木聚糖酶，提高其親和力，又能與酶-底物復合物結(jié)合，降低酶反應速度，從而表現(xiàn)對木聚糖酶的抑制作用。

2.3 單寧酸對酶紫外差示光譜的影響

由圖2可知，纖維素酶和木聚糖酶的最大紫外吸收波長分別為280nm和278nm，這是由于色氨酸和酪氨酸等芳雜環(huán)對光的吸收。蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境改變，會導致最大吸收波長的變化[11-12]。

圖 2 4 mg/mL纖維素酶(a)和木聚糖酶(b)的紫外吸收光譜Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of 4 mg/mL cellulase and xylanase

圖 3 單寧酸對纖維素酶(a)和木聚糖酶(b)紫外差示光譜的影響Fig.3 Ultraviolet difference spectra of cellulase and xylanase before and after reaction with different concentrations of tannic acid

如圖3所示，纖維素酶的吸收峰強度會隨著單寧酸質(zhì)量濃度增加而增大。當單寧酸質(zhì)量濃度達到0.50mg/mL時，強度變化最大。同時，單寧酸會導致纖維素酶最大吸收波長藍移，且質(zhì)量濃度越小，藍移程度越大，最大位移量為56nm。單寧酸質(zhì)量濃度增加也會引起木聚糖酶的吸收峰強度增大。當單寧酸質(zhì)量濃度高于0.13mg/mL時，強度變化較為明顯。與纖維素酶不同的是，木聚糖酶最大吸收波長的變化較為復雜：較高質(zhì)量濃度的單寧酸會導致木聚糖酶最大吸收波長藍移，當質(zhì)量濃度為0.50mg/mL時，最大藍移量為27nm；而較低質(zhì)量濃度的單寧酸會使木聚糖酶最大吸收波長發(fā)生紅移，當質(zhì)量濃度達到0.06mg/mL時，最大紅移量為50nm。

結(jié)果表明，添加單寧酸后，酶分子中色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境受到干擾，進而酶分子結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變。

2.4 單寧酸對酶的熒光淬滅作用

2.4.1 單寧酸對酶熒光淬滅光譜的影響

在蛋白質(zhì)分子中存在色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基，它們含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)或共軛雙鍵，能吸收發(fā)射熒光，所以蛋白質(zhì)具有內(nèi)源熒光。但由于苯丙氨酸熒光極弱，對熒光有貢獻的只有酪氨酸和色氨酸[13-14]。

圖 4 單寧酸對纖維素酶熒光淬滅光譜的影響Fig.4 Fluorescence spectra of cellulase before and after being treated with different concentrations of tannic acid

由圖4可知，分別以278nm和295nm波長光激發(fā)時，纖維素酶的發(fā)射波長分別為340nm和337nm。隨著單寧酸質(zhì)量濃度的增加，纖維素酶的熒光發(fā)射峰強度明顯減少。此外，單寧酸對纖維素酶內(nèi)源光發(fā)射波長的影響較小。在激發(fā)波長為278nm和295nm時，單寧酸所引起的最大紅移量均為5nm。

由圖5可知，木聚糖酶在278nm和295nm波長光激發(fā)下，最大發(fā)射峰分別為354nm和356nm。而且木聚糖酶淬滅程度隨著單寧酸質(zhì)量濃度的增加不斷增強，當單寧酸質(zhì)量濃度達到0.50mg/mL時，熒光幾乎完全淬滅。同樣，木聚糖酶在單寧酸作用下最大發(fā)射波長基本不變，紅移量依次為3nm和5nm。

以上結(jié)果表明：添加的單寧酸與酶蛋白分子中的色氨酸和酪氨酸殘基發(fā)生相互作用，干擾了酶的構(gòu)象，使上述2種氨基酸殘基所處的疏水環(huán)境發(fā)生了明顯變化。此外，不同波長激發(fā)時，熒光發(fā)射峰的強度也不同，278nm激發(fā)明顯強于295nm激發(fā)，這是因為前者會使色氨酸和酪氨酸同時受到激發(fā)，而后者只能激發(fā)色氨酸[15-16]。

圖 5 單寧酸對木聚糖酶的熒光淬滅光譜的影響Fig.5 Fluorescence spectrum of xylanase before and after being treated with different concentrations of tannic acid

2.4.2 單寧酸對酶的熒光淬滅機制

熒光淬滅過程實際上就是與發(fā)光過程相互競爭從而縮短發(fā)光分子激發(fā)態(tài)壽命的過程，可分為動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅2種。動態(tài)淬滅是指淬滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生相互作用(如：能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移)，產(chǎn)生瞬時的激態(tài)復合物，這些復合物可能不發(fā)射熒光，或者熒光的發(fā)射特性與原來的熒光物質(zhì)不同，從而引起熒光淬滅現(xiàn)象。而靜態(tài)淬滅是淬滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時發(fā)生配合反應，產(chǎn)生不發(fā)光的配合物。如果單寧酸對纖維素酶和木聚糖酶的熒光淬滅為動態(tài)淬滅，需滿足Stern-Volmer方程[15-16]，即：

式中：F0為無淬滅劑存在時熒光物質(zhì)的熒光強度；F為淬滅劑存在時熒光物質(zhì)的熒光強度；Kq為分子淬滅常數(shù)；τ0為無淬滅劑存在時物質(zhì)的熒光壽命(生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s[17])；Ksv為動態(tài)淬滅常數(shù)；[Q]為淬滅劑濃度。

選擇278nm波長光激發(fā)時的熒光光譜，以熒光光譜的相關(guān)數(shù)據(jù)做F0/F-[Q]圖，從中求出單寧酸分別與2種酶相互作用后的Kq，再與各類淬滅劑對生物大分子的最大擴散常數(shù)1.0×1010L/(mol·s)比較[17]。結(jié)果表明，2種酶的Kq均大于最大擴散常數(shù)，單寧酸對酶的熒光淬滅作用屬于靜態(tài)淬滅，即反應中形成了以非共價鍵結(jié)合的某種不發(fā)光的配合物。

表3 單寧酸淬滅酶熒光的Stern-Volmer方程Table 3 Parameters obtained from Sterm-Volmer equation after cellulase and xylanase reacted with tannic acids

由于單寧酸能與纖維素酶和木聚糖酶形成非熒光配合物，在此基礎(chǔ)上，進一步可得到兩者之間結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)。按照靜態(tài)淬滅方程[17-18]。

式中：F0為無淬滅劑存在時熒光物質(zhì)的熒光強度；F為淬滅劑存在時熒光物質(zhì)的熒光強度；KA為靜態(tài)結(jié)合常數(shù)；[Q]為淬滅劑濃度；n為結(jié)合位點的數(shù)目。

表4 單寧酸淬滅酶熒光的靜態(tài)淬滅方程Table 4 Static quenching parameters of cellulase and xylanase after reaction with tannic acid

由表4所示，單寧酸與酶分子結(jié)合程度不同，木聚糖酶明顯高于纖維素酶。此外，上述2種酶與單寧酸之間均只有一個結(jié)合位點。

一般來講，多酚類物質(zhì)對酶促反應的抑制作用是多方面因素共同作用的結(jié)果：1)酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)，酶與多酚結(jié)合生成不溶性的結(jié)合物，該結(jié)合物較酶的構(gòu)型有所改變，從而造成酶活力的降低或喪失；2)對于以生物大分子為底物的酶促反應，多酚物質(zhì)也可同底物結(jié)合，剝奪酶的催化底物或生成能降低酶活性的化合物[19]。

根據(jù)Haslam等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，多酚會在蛋白質(zhì)分子之間形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，當反應體系中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度不同時，與多酚的結(jié)合方式也不同[20]。1)當多酚質(zhì)量濃度遠大于蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度時，多酚分子會在蛋白質(zhì)分子表面形成單分子疏水層，其疏水性使多酚-蛋白質(zhì)復合物沉淀析出；2)隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度升高，當其結(jié)合點數(shù)與多酚分子數(shù)目平衡時，形成多酚-蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。理論上講，此時的沉淀量達到最大；3)當?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度遠大于多酚質(zhì)量濃度時，多酚-蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，沉淀量會有所降低。

單寧酸對酶的抑制主要是由于單寧酸與酶的結(jié)合，即單寧酸對酶的抑制具有選擇性，這是因為多酚-蛋白質(zhì)的結(jié)合反應本身是一種分子識別反應，2種反應物之間相互選擇[19]。因此，單寧酸對纖維素酶和木聚糖酶存在不同的有效抑制質(zhì)量濃度。這種選擇性同樣表現(xiàn)在對于不同酶產(chǎn)生不同的抑制作用，單寧酸與纖維素酶結(jié)合，改變其構(gòu)象，進而降低纖維素酶對底物的親和力；相反，單寧酸結(jié)合游離的木聚糖酶，促進其與底物的結(jié)合，同時又與酶-底物復合物結(jié)合，阻礙還原糖的釋放，從而達到抑制效果。

3 結(jié) 論

單寧酸對纖維素酶和木聚糖酶均具有抑制作用。其抑制效果分別在單寧酸質(zhì)量濃度達到1.00、0.50mg/mL時達到最大，此時抑制率依次為35.33%、37.16%。此外，當木聚糖酶反應體系中的單寧酸超過最大抑制質(zhì)量濃度時，其抑制效果會有所降低；若繼續(xù)添加，抑制效果基本保持不變。

動力學研究表明，單寧酸能夠通過不同方式降低兩種酶的活力。單寧酸能夠降低纖維素酶與底物的親和力，從而表現(xiàn)其對纖維素酶的競爭性抑制作用；而對木聚糖酶的抑制作用，表現(xiàn)為與酶-底物復合物結(jié)合，降低酶反應速度，引起還原糖釋放量的降低。

單寧酸能夠干擾酶蛋白分子的構(gòu)象，使酪氨酸和色氨酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生明顯的變化，從而引起纖維素酶和木聚糖酶紫外差示光譜及熒光光譜的變化。酶紫外吸收峰強度會隨著單寧酸質(zhì)量濃度增加而增大，但位移變化較為復雜：低質(zhì)量濃度單寧酸分別會引起纖維素酶及木聚糖酶最大吸收波長的藍移(最大藍移量56nm)和紅移(最大紅移量50nm)；而高質(zhì)量濃度單寧酸會導致木聚糖酶最大吸收波長藍移(最大藍移量27nm)。

熒光光譜結(jié)果表明，單寧酸質(zhì)量濃度越高，對酶的熒光淬滅程度越強，且最大發(fā)射波長出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，紅移范圍是3～5nm。這說明酶蛋白分子中的酪氨酸和色氨酸殘基與單寧酸結(jié)合。通過分析其對2種酶熒光淬滅作用的相關(guān)數(shù)據(jù)，證明單寧酸均能與酶分子的特定位點結(jié)合，形成穩(wěn)定的配合物，從而影響其生物學功能；其結(jié)合部位應為芳香族氨基酸殘基，且只有一個結(jié)合位點。

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