江均平，李春紅，張 濤，云冬梅，楊雪豐

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；3.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206)

胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor，TI)泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的一類物質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，在體內(nèi)能與相應(yīng)的胰蛋白酶形成一定的動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)許多重要的生命活動(dòng)，在生物的生理體系中發(fā)揮重要作用。臨床上TI對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎[1]、輻射損傷[2-3]、HIV和腫瘤[4-6]等有一定的療效；農(nóng)業(yè)上可以用于病蟲害防治；食品工業(yè)上用來(lái)抑制蛋白酶，防止香腸、肉丸、低鹽魚產(chǎn)品、海洋藍(lán)鲹魚糜凝膠軟化[7-8]，改善肉類食品的質(zhì)構(gòu)。

但是TI是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，抑制消化道胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性，降低蛋白質(zhì)的消化。另外，TI與腸內(nèi)胰蛋白酶結(jié)合后隨糞便排出體外，使腸內(nèi)胰蛋白酶數(shù)量減少，引起胰腺反射性亢進(jìn)，分泌量加大，同時(shí)腸促胰酶肽分泌也增加，這種雙重的過分刺激胰腺分泌，勢(shì)必造成胰腺分泌失調(diào)性肥大和增生[9]。胰蛋白酶中含有豐富的含硫氨基酸，體內(nèi)胰蛋白酶的流失會(huì)造成體內(nèi)含硫氨基酸的內(nèi)源性散失，致使體內(nèi)氨基酸代謝失調(diào)或不平衡。

綠豆(Vigna radiata(L.) R. Wilczek)原產(chǎn)于中國(guó)，已有2000多年的栽培史，印度、緬甸、朝鮮、日本等國(guó)均有栽培，在人們生活中占有十分重要的地位。綠豆中含有一定量的TI，其比活力是大豆TI的2.76倍[10]，而且耐熱、耐酸[11]，但目前缺乏大面積栽種品種TI含量、多型性及穩(wěn)定性的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)對(duì)綠豆TI資源的開發(fā)利用以及科學(xué)食用綠豆都有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆品種26份，來(lái)自我國(guó)主產(chǎn)區(qū)，品種名稱和產(chǎn)地見表1；紅豆品種：遼引紅豆(產(chǎn)地遼寧沈陽(yáng))、京農(nóng)21、XD1(產(chǎn)地吉林白城)；黑豆品種：綏03-3772(產(chǎn)地黑龍江齊齊哈爾)、成都安德公司小粒黑豆、中農(nóng)綠谷公司小粒黑豆。

苯甲酰-DL-精氨酸-對(duì)硝基酰胺鹽(BAPNA) 美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶(1：250)(酶活力＞250NFU/mg) 美國(guó)Bio Basic公司；明膠為化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

1093 CYCLOTEC旋風(fēng)磨 瑞典Foss公司；UV-752型紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析公司；TU-20DTEMPUN IT精密恒溫水浴鍋 英國(guó)Techne公司；DYY-8C電泳儀 北京六一公司。

1.3 酶的提取

綠豆用旋風(fēng)磨磨成8 0 目，置于冰箱備用。取1000.0mg綠豆粉用20mL蒸餾水于150mL三角瓶中180r/min振蕩提取1h(37℃)，12000r/min離心10min得提取液。

1.4 胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定

1.4.1 測(cè)定原理

參照文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行。胰蛋白酶可催化水解BAPNA，引起410nm波長(zhǎng)處吸光度增加，而胰蛋白酶抑制劑加入上述體系后，抑制了胰蛋白酶的活性，使410nm波長(zhǎng)處吸光度增加的幅度有所減少，以其減少程度表示此抑制劑的抑制能力，從而計(jì)算出抑制活性。

1.4.2 溶液配制

Tris-HCl緩沖液：0.294g CaCl2·H2O用100mL 0.05mol/L、pH8.2 Tris-HCl緩沖液溶解；BAPNA溶液：20.0mg BAPNA先用0.5mL二甲基亞砜溶解，再用37℃的Tris-HCl緩沖液定容至50mL；胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶40mg先用2mL 1mmol/L鹽酸溶解，再用蒸餾水定容至50mL。

1.4.3 指標(biāo)測(cè)定

1.4.3.1 胰蛋白酶活性測(cè)定

Tris-HCl緩沖液0.5mL、提取劑(dH2O)0.2mL、胰蛋白酶溶液0.2mL，37℃保溫5min后，加入BAPNA溶液0.5mL，保溫10min后加入乙酸0.2mL，混勻，以空白對(duì)照(即在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)最后加酶液)作參比，測(cè)定410nm波長(zhǎng)處的吸光度(AT)。

1.4.3.2 蛋白酶抑制劑活性測(cè)定

Tris-HCl緩沖液0.5mL、TI溶液0.2mL、胰蛋白酶溶液0.2mL，37℃保溫5min后，加入BAPNA溶液0.5mL，保溫10min后加入30%乙酸0.2mL，混勻，以空白對(duì)照(在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)最后加酶液)作參比，測(cè)定410nm波長(zhǎng)處的吸光度(ATI)。

1.4.3.3 計(jì)算方法

抑制劑活性單位定義為：在上述反應(yīng)條件下抑制1mg 1：250的胰蛋白酶活性所需要的抑制劑量為1個(gè)單位(TIU)。

1.5 高溫對(duì)抑制劑穩(wěn)定性的影響

取0.5mL提取液于帶螺旋蓋的菌種冷凍管中，加入0.5mL蒸餾水，擰緊蓋子，于100℃水中30min，取出立即于自來(lái)水中冷卻，然后檢測(cè)殘余活性及酶譜變化。

1.6 酸性條件對(duì)抑制劑穩(wěn)定性的影響

吸取0.5mL上清液于離心管中，再加入0.5mL 0.05mol/L、pH1.5的KCl-HCl緩沖液，靜置8h。然后檢測(cè)殘余活性及酶譜變化。

1.7 電泳分析[14-15]

稱取1000.0mg豆粉用50mL蒸餾水于150mL三角瓶中振蕩提取1h (37℃、180r/min)，12000r/min離心10min得TI提取液。提取液用蒸餾水稀釋5倍，與等體積電泳樣品緩沖液混合，取20μL進(jìn)行明膠-PAGE。采用不連續(xù)垂直平板電泳系統(tǒng)，5%濃縮膠，12%分離膠，兩種膠均含0.2%明膠，電極緩沖液為pH 8.3 Tris-甘氨酸；濃縮膠電壓80V，分離膠150V，待溴酚藍(lán)帶跑出膠后繼續(xù)電泳1h；取膠于培養(yǎng)皿中，用100mL胰蛋白酶溶液(25μg/mL，用脫酶液配制)振動(dòng)酶解20min(搖床轉(zhuǎn)速50r/min、37℃)，倒盡酶液，倒置培養(yǎng)皿，繼續(xù)保溫90min，然后用50mL脫酶液(pH7.5 0.05mol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl，0.01mol/L CaCl2)漂洗凝膠2min，共漂洗3次；考馬斯亮藍(lán)R-250染色60min(搖床轉(zhuǎn)速50r/min、37℃)，0.25mol/L NaCl溶液脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同綠豆種質(zhì)胰蛋白酶抑制劑含量

表1 不同綠豆品種胰蛋白酶抑制劑活性(±s，n=3)Table 1 TI activity of mung bean cultivars (±s，n=3)

表1 不同綠豆品種胰蛋白酶抑制劑活性(±s，n=3)Table 1 TI activity of mung bean cultivars (±s，n=3)

綠豆 產(chǎn)地TI活性/(TIU/g)綠豆 產(chǎn)地TI活性/(TIU/g)鄭綠8號(hào) 河南南陽(yáng)35.2±0.3白綠522吉林白城42.2±2.6冀綠7號(hào) 河北石家莊53.5±2.2白綠8號(hào) 吉林白城35.4±3.3冀綠8號(hào) 河北石家莊42.0±2.4保942-34吉林白城32.7±1.7冀綠9號(hào) 河北石家莊31.2±2.1保綠942吉林白城40.7±0.7橫山大明綠豆 陜西榆林38.4±3.3大鸚哥綠935吉林白城35.1±1.6神木綠豆 陜西榆林36.0±4.7冀綠19-2吉林白城43.2±2.2淮綠5號(hào) 山東青島49.6±4.8冀綠2號(hào) 吉林白城37.5±2.9突泉明綠豆 內(nèi)蒙古突泉44.0±2.2佳木斯綠 吉林白城35.4±3.4扎魯特綠豆 內(nèi)蒙古突泉30.2±0.7金峰綠豆直徑3.6吉林白城29.0±0.3遼綠8號(hào) 遼寧沈陽(yáng)43.2±5.7金峰綠豆直徑3.8吉林白城33.6±1.7綠豐5號(hào) 黑龍江齊齊哈爾 34.8±2.2品種2號(hào) 吉林白城41.3±2.6綠豐2號(hào) 黑龍江齊齊哈爾 36.4±0.0中綠5號(hào) 吉林白城51.3±1.4 200143-10綠 吉林白城35.5±0.0中綠10號(hào) 吉林白城43.5±1.7

由表1 可知，2 6 個(gè)綠豆栽培品種T I 平均含量為38.9TIU/g，冀綠7號(hào)、中綠5號(hào)活性最高，分別達(dá)53.5、51.3TIU/g，金峰綠豆直徑3.6最低，只有29.0TIU/g，高低相差0.8倍。

2.2 綠豆胰蛋白酶抑制劑多型性

圖 1 綠豆、紅小豆、黑大豆TI活性電泳酶譜Fig.1 TI zymogram of mung bean, adzuki bean and black soybean on Gel-PAGE

用非變性電泳TI活性染色方法對(duì)3個(gè)綠豆品種、3個(gè)紅小豆品種以及3個(gè)黑大豆品種TI進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。綠豆有4條帶，M2為主要組分，M4次之，其他微量；紅小豆有7條帶，其中A4為主要組分，A2、A6次之，其他微量，京農(nóng)21缺失A3，A2含量也極低；黑大豆有8條帶，S3為主要組分，S4、S7、S8為次要組分，其他微量。

2.3 綠豆胰蛋白酶抑制劑耐熱性

圖 2 綠豆TI熱、酸處理活性顯色電泳圖Fig.2 TI activity staining PAGE of crude extract from mung bean treated by heat and acid

TI提取液于沸水中處理30min，冀綠7號(hào)、中綠5號(hào)、淮綠5號(hào)這3個(gè)品種的殘余活性為66.4%～83.1%(表2)，明膠-PAGE活性顯色有一定強(qiáng)度的活性帶，見圖2B，表明綠豆TI具有較高的耐熱性。冀綠7號(hào)M4消失，出現(xiàn)5條新帶(M5～M9)，中綠5號(hào)、淮綠5號(hào)未產(chǎn)生新帶。

表2 綠豆胰蛋白酶抑制劑酸、熱穩(wěn)定性Table 2 Thermal and pH stability of mung bean TI

2.4 綠豆胰蛋白酶抑制劑耐酸性

由表2可知，TI提取液經(jīng)pH1.5處理8h，冀綠7號(hào)、中綠5號(hào)的活性有所增加，達(dá)110.0%和107.7%，淮綠5號(hào)保存86.3%的活性，表明綠豆TI耐酸?；钚噪娪窘Y(jié)果表明，冀綠7號(hào)M4消失，出現(xiàn)5條新帶(M5～M9)(圖2A)，中綠5號(hào)、淮綠5號(hào)未產(chǎn)生新帶。

3 討論與結(jié)論

3.1 TI種類及含量

供試的26個(gè)綠豆品種平均含38.9TIU/g，品種間差異較大，高低相差0.8倍。實(shí)驗(yàn)對(duì)3種黑大豆、17種紅小豆的TI含量進(jìn)行了測(cè)定，綠豆平均含量比紅小豆、黑大豆低5倍以上。綠豆有4種TI，其中M2為主要組分。紅小豆、黑大豆分別有7種、8種TI，主要組分分別為A4、S3。豆類TI種類及含量與植物品種、生理狀態(tài)以及受病蟲侵害程度有關(guān)[16]，TI的多型性具有重要的生物學(xué)意義，因?yàn)門I參與多種生理活動(dòng)，因此需要不同種類和豐度的TI，如種子萌發(fā)、抗病蟲等。據(jù)報(bào)道[17]新原料TI含量最高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取液在冰箱放置一定時(shí)間后酶譜會(huì)改變。放置10d后M4顯著增加，M1、M2、M3明顯減少，因此，在研究TI多型性和含量時(shí)，必須用新材料及新提取液。

3.2 熱穩(wěn)定性

Klomklao等[11]報(bào)道綠豆TI經(jīng)90處理60min可以保存90%以上的活性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明綠豆TI具有較高的熱穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明普通烹調(diào)方法不能完全使其失活。經(jīng)100℃煮30min冀綠7號(hào)的M4消失，同時(shí)產(chǎn)生了M5～M9共5條活性帶。

3.3 酸穩(wěn)定性

Klomklao等[11]報(bào)道綠豆TI經(jīng)pH2.0緩沖液處理30min保存87%的活性，本實(shí)驗(yàn)研究的3種綠豆經(jīng)pH1.5處理8h，其中有2種的活性高于原液，另一種保存86.3%的活性，表明綠豆TI可以耐受胃酸。經(jīng)pH1.5處理，冀綠7號(hào)的M4消失，同時(shí)產(chǎn)生了M5～M9共5條活性帶。

3.4 TI存在狀態(tài)

冀綠7 號(hào)經(jīng)熱或酸處理后M4消失，同時(shí)產(chǎn)生了M5～M9共5條新活性帶，推測(cè)M4是以結(jié)合態(tài)形式存在。

利用明膠-PAGE分析TI種類和豐度受多因素的影響，如加樣量、胰蛋白酶質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間、溫度以及酶解方式。本研究采用低胰蛋白酶質(zhì)量濃度(25μg/mL)、短時(shí)間(20min)浸泡酶解，然后倒掉酶液繼續(xù)保溫90min讓殘留在凝膠中的胰蛋白酶將明膠水解，這樣可以避免TI被溶液中過量的蛋白酶所飽和而被降解，從而能夠比較精細(xì)、準(zhǔn)確分析TI種類及豐度。

綠豆TI屬于Borman-Birk型絲氨酸蛋白酶抑制劑，由72個(gè)氨基酸殘基組成，分子中含有7對(duì)二硫鍵[18-19]，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，耐熱耐酸，常規(guī)加熱烹調(diào)和胃酸不能使其完全失活。豆類TI一方面可以抑制蛋白酶的活性影響蛋白的利用，但TI也具有一定的抑癌效果[4-6]，因此，如何科學(xué)食用綠豆值得深入研究。

[1] LICHTENSTEIN G R, DEREN J J, KATZ S, et a1. Bowman-Birk inhibitor concentrate： a novel therapeutic agent for patients with active ulcerative colitis[J]. Dig Dis Sci, 2008, 53： 175-180.

[2] KATOH H, ISHIKAWA H, HASEGAWA M, et a1. Protective effect of urinary trypsin inhibitor on the development of radiation-induced lung fibrosis in mice[J]. J Radiat Res(Tokyo), 2010, 51(3)： 325-332.

[3] DITTMANN K, MAYER C, KEHLBACH R, et a1. The radioprotector Bowman-Birk proteinase inhibitor stimulates DNA repair via epidermal growth factor receptor phosphorylation and nuclear transport[J]. Radiotherapy and Oncology, 2008, 86： 375-382.

[4] FANG E F, HASSANIEN A A, WONG J H, et al. Isolation of a new trypsin inhibitor from the Faba bean (Vicia faba cv. Giza 843) with potential medicinal applications[J]. Protein Pept Lett, 2011, 18(1)： 64-72.

[5] MA D Z, SUN J, ZHANG G Q, et a1. A storage protein-like trypsin inhibitor from the Moth bean (Phaseolus acutifolius) with antiproliferative activity toward lymphoma cells[J]. Protein Pept Lett, 2010, 17(6)： 782-788.

[6] HO V S, NG T B. A Bowman-Birk trypsin inhibitor with antiproliferative activity from Hokkaido large black soybeans[J]. J Pept Sci, 2008, 14： 278-282.

[7] GARCIA-CARRENO F L, TORO M A N, DIAZCOPEZ M P, et a1. Proteinase inhibition of fish muscle enzymes using legume seed extracts[J]. J Food Prot, 1996, 59： 312-318.

[8] SUN L C, YOSHIDA A, CAI Q F, et a1. Mung bean trypsin inhibitor is effective in suppressing the degradation of myofibrillar proteins in the skeletal muscle of blue scad (Decapterus maruadsi)[J]. J Agric Food Chem, 2010, 58(24)： 12986-12992.

[9] KAMALAKANNAN V, SATHYAMOORTHY A V, MOTLAG D B. Effect of the dietary black gram trypsin inhibitory fraction on the pancreatic activity of male Albino mice[J]. Res Exp Med, 1984, 184： 91-101.

[10] 劉同祥, 牛建昭, 許惠玉, 等. 綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離和純化[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2007(3)： 145-148.

[11] KLOMKLAO S, BENJAKUL S, KISHIMURA H, et a1. Extraction, purification and properties of trypsin inhibitor from Thai mung bean (Vigna radiata (L.) R. Wilczek)[J]. Food Chemistry, 2011, 129： 1348-1354.

[12] Measurement of trypsin inhibitor activity of soya productsspectrophotometric method[S]. USA AACC 10th Edition.

[13] 燕方龍, 華蕾. 大豆制品中胰蛋白酶抑制劑的抑制活性測(cè)定[M]. 理化檢驗(yàn)： 化學(xué)分冊(cè), 2007： 226-228.

[14] 黃國(guó)偉, 巫光宏, 何嘉雯, 等. 測(cè)定豆類胰蛋白酶抑制劑活性和種類的電泳方法改良[J]. 大豆科學(xué), 2010(2)： 315-318.

[15] FELICIOLI R, GARZELLI B, VACCARI L, et a1. Activity staining of protein inhibitors of proteases on gelatin-containing polyacrylamide gel electrophoresis[J]. Analytical Biochemistry, 1997, 244： 176-179.

[16] El-SHAMEI Z, WU J W, HAARD N F. Influence of wound injury on accumulation of proteinase inhibitors in leaf and stem tissues of two processing tomato cultivars[J]. Journal of Food Biochemistry, 1996, 20： 155-171.

[17] GLADYSHEVA I P, BALABUSHEVICH N G, MOROZ N A, et a1. Isolation and characterization of soybean Bowman-Birk inhibitor from different sources[J]. Biochemistry, 2000, 65(2)： 198-203.

[18] ZHANG Y, LUO S, TAN F, et a1. Complete amino acid sequence of mung bean trypsin inhibitor[J]. Scientia Sinica (Series B), 1982, 25(3)： 268-277.

[19] LIN G, BODE W, HUBER R, et a1. The 0.25 nm X-ray structure of the Bowman-Birk-type inhibitor from mung bean in ternary complex with porcine trypsin[J]. Eur J Biochem, 1993, 212(2)： 549-555.