林標(biāo)聲，羅茂春*

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2.龍巖學(xué)院閩西食品研究所，福建 龍巖 364012；3.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 龍巖 364012)

蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris)，又名北冬蟲(chóng)夏草，是一種珍稀的藥用菌，與冬蟲(chóng)夏草同屬異種[1-2]。蛹蟲(chóng)草含有蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草素、核苷類(lèi)、甾醇類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)成分和人體必需的氨基酸、維生素和過(guò)氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等多種生物活性物質(zhì)[3-4]，在降血脂、防止動(dòng)脈硬化、調(diào)整中樞神經(jīng)功能、延長(zhǎng)睡眠、抗炎、抗癌、抗菌、抗衰老[5]等方面都有良好功效，是一種良好的營(yíng)養(yǎng)和滋補(bǔ)佳品。目前，國(guó)內(nèi)外已有大量的人工栽培蛹蟲(chóng)草，如固體栽培子實(shí)體和液體深層發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體等，經(jīng)檢測(cè)其活性成分和含量均與野生蛹蟲(chóng)草相當(dāng)[6-7]。人工栽培蛹蟲(chóng)草的出現(xiàn)可為蛹蟲(chóng)草保健食品的工業(yè)化生產(chǎn)提供充足的原料來(lái)源。

山楂(Crataegus pinnatifi da)，是薔薇科、蘋(píng)果亞科、山楂屬植物的果實(shí)，具有開(kāi)胃消食、防治心血管疾病、平喘化痰、防衰老、抗癌、抑菌等作用[8]。山楂酸甜可口、營(yíng)養(yǎng)豐富，幾乎含有水果的所有營(yíng)養(yǎng)成分，特別是有機(jī)酸和維生素C的含量較高，因此山楂也非常適合于做特殊風(fēng)味的飲料[9]。

據(jù)報(bào)道，蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵中，70%以上的蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草酸分布在發(fā)酵液中[10]，活性成分極其豐富。因此，本研究采用添加山楂于蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行風(fēng)味調(diào)配，研制成具有保健功能和山楂酸甜口味的復(fù)合保健飲料，為蛹蟲(chóng)草功能食品向多元化方向發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使其加工更精細(xì)、配方更科學(xué)、功能更明確、效果更顯著。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲(chóng)草菌株由龍巖學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；山楂、蔗糖、檸檬酸、糊精 市售。

蛹蟲(chóng)草菌種培養(yǎng)基：土豆200g，蛋白胨5g，酵母膏5g，KH2PO41g，MgSO40.5g，瓊脂20.0g，自然pH值，水1000mL；蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：土豆200g，葡萄糖12g，玉米粉15g，蛋白胨5g，酵母膏5.7g，KH2PO41g，MgSO40.5g，pH6.4，水1000mL。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-2102雙層全溫度振蕩器 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；VD-650型無(wú)菌操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HHS-12 雙孔電熱恒溫水浴鍋 北京衡器公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲(chóng)草菌種的活化、篩選

將本實(shí)驗(yàn)室保藏的5株蛹蟲(chóng)草菌種在菌種培養(yǎng)基上進(jìn)行活化、傳代， 24℃培養(yǎng)6d，培養(yǎng)過(guò)程中定期對(duì)蛹蟲(chóng)草菌株進(jìn)行觀察并測(cè)定菌落直徑，挑選長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良、性能良好的菌株用于以下液體發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.2 山楂液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

挑選新鮮無(wú)霉?fàn)€的山楂，經(jīng)清水洗凈后切碎待用。在50mL蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別添加5、8、11、14、17g山楂，混合均勻(山楂懸浮于培養(yǎng)液中，pH5.0～6.4)，以不添加山楂為對(duì)照，分別在雙層全溫度振蕩器進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)(24℃，150r/min，培養(yǎng)6d)，觀察蛹蟲(chóng)草菌絲生長(zhǎng)情況，并綜合考慮培養(yǎng)液的澄清度、顏色、氣味等因素，以發(fā)酵液呈淡棕紅色或淺咖啡色、澄清透明、有光澤、具有蛹蟲(chóng)草和山楂獨(dú)特的甜香氣、無(wú)其他異味、無(wú)雜質(zhì)及懸浮物、均勻一致為100分進(jìn)行評(píng)價(jià)打分，確定蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵培養(yǎng)基中最適的山楂添加量。

1.3.3 復(fù)合保健飲料研制的工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：發(fā)酵：24℃，150r/min，培養(yǎng)6d；離心：4000r/min離心10min，取上清液；過(guò)濾：八層紗布過(guò)濾；均質(zhì)：混合后的物料在20MPa的高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)，防止分層沉淀；滅菌：均質(zhì)后的物料灌裝于玻璃瓶中，灌裝后真空封罐，真空度控制在360mm Hg以上，采用巴氏消毒。

1.3.4 復(fù)合保健飲料的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

復(fù)合保健飲料殺菌后，立即由實(shí)驗(yàn)室的10名同學(xué)對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)分，每次評(píng)分前用溫開(kāi)水漱口。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示，綜合感官評(píng)價(jià)分值/分＝20%×外觀形態(tài)評(píng)分＋20%×色澤評(píng)分＋20%×風(fēng)味評(píng)分＋40%×口感評(píng)分[11-12]。

表 1 復(fù)合保健飲料的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards for assessment of compounded health beverage

1.3.5 復(fù)合保健飲料調(diào)配工藝的優(yōu)化

1.3.5.1 復(fù)合保健飲料調(diào)配的單因素試驗(yàn)

1) 蛹蟲(chóng)草發(fā)酵醪液添加量：蛹蟲(chóng)草本身具有特殊的清香微苦的味道，復(fù)合飲料中含發(fā)酵液過(guò)多或過(guò)少，都會(huì)影響飲料的口感[13]。

選定復(fù)合飲料中分別添加體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的發(fā)酵醪液，考察復(fù)合飲料的綜合感官評(píng)價(jià)，確定較適的發(fā)酵醪液用量。

2) 蔗糖添加量：分別在復(fù)合飲料中添加4、5、6、7、8g/100mL的蔗糖調(diào)節(jié)口感，考察復(fù)合飲料的綜合感官評(píng)價(jià)，確定較適的蔗糖用量。

3) 檸檬酸添加量：分別在復(fù)合飲料中添加0.04、0.06、0.08、0.1、0.12g/100mL的檸檬酸作為調(diào)味劑，考察復(fù)合飲料的綜合感官評(píng)價(jià)，確定較適的檸檬酸用量。

4) 穩(wěn)定劑添加量：β-環(huán)狀糊精是一種良好的穩(wěn)定劑和矯味劑，能包絡(luò)各種化合物分子，增加被包絡(luò)物對(duì)光熱、氧的穩(wěn)定性，在食品制造方面主要用來(lái)消除異味，提高香料香精以及色素的穩(wěn)定性，增強(qiáng)乳化能力和防潮能力。單純的發(fā)酵濾液不僅口感不夠豐滿(mǎn)，而且飲料本身也不夠穩(wěn)定，添加穩(wěn)定劑糊精可以改善口感和飲品的穩(wěn)定性[14]，能夠更長(zhǎng)時(shí)間的保存。因此，本研究分別在復(fù)合飲料中添加0.05、0.10、0.15、0.20、0.25g/100mL的糊精作為穩(wěn)定劑，考察復(fù)合飲料的綜合感官評(píng)價(jià)，確定較適的穩(wěn)定劑糊精用量。

各組單因素試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，分析各組差異。

1.3.5.2 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合保健飲料中各因素的調(diào)配

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面分析法，以產(chǎn)品感官品質(zhì)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用Design-Expert 軟件在4因素3水平上對(duì)復(fù)合保健飲料調(diào)配的蛹蟲(chóng)草發(fā)酵醪液用量、蔗糖添加量、檸檬酸添加量、穩(wěn)定劑添加量進(jìn)行優(yōu)化，確定最適的復(fù)合保健飲料調(diào)配方案。

1.3.6 復(fù)合保健飲料的產(chǎn)品鑒定和保質(zhì)期試驗(yàn)

對(duì)所研制的復(fù)合保健飲料從外觀、口感、微生物指標(biāo)、保質(zhì)期等方面進(jìn)行檢測(cè)，保證產(chǎn)品符合食品安全生產(chǎn)要求[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

山楂液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備結(jié)果如圖1所示。菌絲體干質(zhì)量的測(cè)定方法為取100mL的發(fā)酵液，離心取菌絲體，60℃恒溫干燥，稱(chēng)量[17]。

圖 1 山楂添加量液體發(fā)酵培養(yǎng)基制備結(jié)果Fig.1 Results of preparation of liquid culture medium with different additive amounts of hawthorn

由圖1可知，添加山楂后菌絲體質(zhì)量均大于未添加山楂的菌絲體質(zhì)量，表明添加山楂后，蛹蟲(chóng)草菌株生長(zhǎng)得更好；綜合菌體生長(zhǎng)情況和發(fā)酵液綜合評(píng)分情況，山楂添加量為11g/50mL時(shí)，其菌體質(zhì)量最大、綜合評(píng)分最高，因此確定蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵培養(yǎng)基中最適的山楂添加量為11g/50mL。

2.2 復(fù)合保健飲料調(diào)配的單因素試驗(yàn)

2.2.1 蛹蟲(chóng)草發(fā)酵醪液添加量

圖 2 發(fā)酵醪液添加量對(duì)復(fù)合飲料綜合感官評(píng)價(jià)的影響Fig.2 Effect of fermented liquid usage on the comprehensive sensory score of composite healthy beverage

如圖2所示，發(fā)酵醪液添加量為60%、70%和80%時(shí)，復(fù)合飲料的綜合感官評(píng)價(jià)值較高，因此選定該3個(gè)數(shù)值作為響應(yīng)面法優(yōu)化的因素水平。

2.2.2 蔗糖添加量

圖 3 蔗糖添加量對(duì)復(fù)合飲料綜合感官評(píng)價(jià)的影響Fig.3 Effect of sucrose usage on the comprehensive sensory score of composite healthy beverage

如圖3所示，蔗糖添加量為5、6、7g/100mL時(shí)，復(fù)合飲料的綜合感官評(píng)價(jià)值較高，因此選定該3個(gè)數(shù)值作為響應(yīng)面法優(yōu)化的因素水平。

2.2.3 檸檬酸添加量

圖 4 檸檬酸添加量對(duì)復(fù)合飲料綜合感官評(píng)價(jià)的影響Fig.4 Effect of citric acid usage on the comprehensive sensory score of composite healthy beverage

如圖4 所示，檸檬酸添加量為0.0 8、0.1 0、0.12g/100mL時(shí)，復(fù)合飲料的綜合感官評(píng)價(jià)值較高，因此選定該3個(gè)數(shù)值作為響應(yīng)面法優(yōu)化的因素水平。

2.2.4 穩(wěn)定劑添加量

圖 5 穩(wěn)定劑添加量對(duì)復(fù)合飲料綜合感官評(píng)價(jià)的影響Fig.5 Effect of stabilizing agent usage on the comprehensive sensory score of composite healthy beverage

如圖5所示，穩(wěn)定劑β-環(huán)狀糊精添加量為0.10、0.15、0.20g/100mL時(shí)，復(fù)合飲料綜合感官評(píng)價(jià)值較高，因此選定該3個(gè)數(shù)值作為響應(yīng)面法優(yōu)化的因素水平。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合保健飲料中各因素的調(diào)配

表 2 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平編碼表Table 2 Coded values of Box-Behnken design

表 3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results

表 4 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 4 Results of analysis of variance of regression model

以綜合感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，4因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)如表2所示，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。利用Design-Expert 7.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到復(fù)合保健飲料綜合評(píng)分和各因素變量之間的二元回歸方程為：Y= 94.86000＋3.55000A＋1.59167B＋2.55833C＋0.11667D－0.02500AB＋1.20000AC＋2.12500AD－1.72500BC－1.27500BD－0.15000CD－4.89667A2－4.03417B2－2.45917C2－7.79667D2。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方程分析，結(jié)果如表4所示。該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0001＜0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.2347＞0.05)，表明回歸方程擬合情況好，誤差小，能較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該方程確定復(fù)合保健飲料中各因素的最適調(diào)配比例。從各因素方差分析結(jié)果可知，對(duì)復(fù)合保健飲料綜合感官評(píng)分影響大小的順序依次為發(fā)酵醪液添加量(A)＞檸檬酸添加量(C)＞蔗糖添加量(B)＞穩(wěn)定劑添加量(D)，其中發(fā)酵醪液用量(A)和檸檬酸添加量(C)對(duì)響應(yīng)值結(jié)果影響極其顯著，蔗糖添加量(B)對(duì)響應(yīng)值結(jié)果影響顯著，穩(wěn)定劑添加量(D)對(duì)響應(yīng)值結(jié)果影響不顯著。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

圖 6 復(fù)合保健飲料調(diào)配各因素交互作用響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface showing the interactions of formulation parameters on the comprehensive sensory score of composite healthy beverage

如圖6所示，根據(jù)所得模型可預(yù)測(cè)復(fù)合保健飲料中各因素的最優(yōu)調(diào)配工藝條件為發(fā)酵醪液添加量74.49%、蔗糖添加量6.06g/100mL、檸檬酸添加量0.11g/100mL，穩(wěn)定劑添加量0.15g/100mL，在該條件下復(fù)合保健飲料的綜合評(píng)分能達(dá)到97.4843分。

2.5 工藝條件優(yōu)化條件下的模型驗(yàn)證

分別按上述的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，所得的蛹蟲(chóng)草復(fù)合保健飲料的綜合評(píng)分均值為97.38分，與理論預(yù)測(cè)值97.4843分接近，重復(fù)性較好，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化所得的工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確、可靠、可行。

2.6 復(fù)合保健飲料的產(chǎn)品鑒定和保質(zhì)期試驗(yàn)

對(duì)所研制的復(fù)合保健飲料從外觀、口感、微生物指標(biāo)等方面進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：飲料外觀均勻一致，呈淡棕紅色或淺咖啡色，澄清透明，有光澤；組織狀態(tài)均勻穩(wěn)定，無(wú)分層、沉淀現(xiàn)象，無(wú)雜質(zhì)及其懸浮物；口感香甜爽口，具有濃郁清的蛹蟲(chóng)草和山楂獨(dú)特的甜香氣，回味愉快，無(wú)其他異味。微生物學(xué)檢驗(yàn)表明：細(xì)菌總數(shù)≤100個(gè)/mL，大腸桿菌≤3個(gè)/100mL，無(wú)致病菌檢出。

將產(chǎn)品分別置于5、25、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，質(zhì)量衛(wèi)生指標(biāo)每周檢測(cè)一次，1個(gè)月質(zhì)量各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定，保質(zhì)期能達(dá)到1年。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)初步具有山楂風(fēng)味的蛹蟲(chóng)草復(fù)合保健飲料的研制，通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化其加工工藝各調(diào)配參數(shù)比例，結(jié)果表明：在50mL蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別添加11g山楂制備成發(fā)酵液，接種優(yōu)良的蛹蟲(chóng)草菌種進(jìn)行液體發(fā)酵，取發(fā)酵液，按發(fā)酵醪液添加量74.49%、蔗糖添加量6.06g/100mL、檸檬酸添加量0.11g/100mL、穩(wěn)定劑添加量0.15g/100mL 進(jìn)行調(diào)配制備復(fù)合保健飲料，經(jīng)檢驗(yàn)，該條件下復(fù)合保健飲料外觀形態(tài)、色澤、口感等均為最佳，綜合評(píng)分最高，且符合國(guó)家食品生產(chǎn)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

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