劉 欣，祝長(zhǎng)青,，王毅謙，沈 赟，黃 明,*，蔣 原，周光宏

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 210001；3.江蘇疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210009)

大豆是我國(guó)乃至全世界重要的經(jīng)濟(jì)與糧食作物，是食用油和植物蛋白最豐富、最廉價(jià)的來源。為了提高大豆的產(chǎn)量，滿足人們對(duì)大豆的需求量，科研人員采用基因工程與分子輔助育種方法，培育了一些高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗逆以及適合農(nóng)場(chǎng)機(jī)械化種植的轉(zhuǎn)基因大豆品種。2010年國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)的數(shù)據(jù)顯示：2010年轉(zhuǎn)基因大豆仍然是最主要的轉(zhuǎn)基因作物，種植面積約7330萬公頃，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的50%左右。中國(guó)從上世紀(jì)末開始進(jìn)口耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆，各種與轉(zhuǎn)基因大豆相關(guān)的產(chǎn)品越來越多地進(jìn)入市場(chǎng)[1]。目前，對(duì)于轉(zhuǎn)基因食品的安全性存在很多爭(zhēng)議，各國(guó)先后制定了有關(guān)轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)、標(biāo)識(shí)以及管理的各項(xiàng)措施[2-3]。為保障廣大消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，滿足國(guó)際貿(mào)易的需要，建立準(zhǔn)確、快速、高效的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)至關(guān)重要。核酸檢測(cè)技術(shù)，尤其是常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和實(shí)時(shí)熒光PCR法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品生物安全檢驗(yàn)等多個(gè)領(lǐng)域[4-5]，成為目前成熟的主流基因檢測(cè)平臺(tái)。核酸檢測(cè)的關(guān)鍵因素是提取到高質(zhì)量的DNA[6]。不同植物材料的DNA提取方法各異，但是總體思路都是先用去污劑將細(xì)胞膜及核膜破裂，然后用化學(xué)藥劑將蛋白質(zhì)及多糖沉淀去除，最后沉淀純化DNA[7]。大豆材料中因含有較多的蛋白和脂類，其DNA提取的難度較大[6]。提取大豆DNA常使用SDS法提取大豆幼嫩葉片的DNA，獲得的大豆DNA質(zhì)量較高，但是需要耗費(fèi)大量的時(shí)間與精力將大豆培養(yǎng)至幼苗期[8]，難以應(yīng)用于實(shí)際轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)與進(jìn)出口大豆檢測(cè)常從大豆子粒中提取DNA，這樣可以節(jié)省植物幼苗的培育時(shí)間。國(guó)內(nèi)外學(xué)者、生物公司也在大豆子粒DNA提取上進(jìn)行研究，開發(fā)了一些基于SDS和CTAB的大豆子粒DNA提取方法[9-10]以及相關(guān)試劑盒。

本研究以大豆子粒為材料，比較Bayer、DuPont、Monsanto公司提供的3種大豆DNA提取方法以及國(guó)際上使用較多的商品化Qiagen試劑盒法、國(guó)內(nèi)廣泛使用的Tiangen試劑盒法，通過紫外分光光度法、瓊脂糖凝膠電泳法、實(shí)時(shí)熒光PCR法分析5種方法提取的大豆DNA質(zhì)量，優(yōu)選出合適的大豆DNA提取方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，滿足我國(guó)國(guó)內(nèi)以及進(jìn)出口農(nóng)產(chǎn)品與食品中轉(zhuǎn)基因檢測(cè)與標(biāo)識(shí)的法規(guī)需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆子粒由江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心提供，用Vorwerk攪拌器研磨成細(xì)粉，用于DNA提取。

植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號(hào)：69106) 德國(guó)Qiagen公司；植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號(hào)：DP320-02) 北京Tiangen公司；λ DNA/Hind Ⅲ Marker、Proteinase K、RNase A 日本Takara公司；瓊脂糖 基因科技(上海)有限公司；熒光PCR擴(kuò)增試劑LightCycler 480 Probes Master預(yù)混液 瑞士Roche公司；大豆凝集素基因(lectin)引物 上海輝睿生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

攪拌器 德國(guó)Vorwerk公司；雜交爐 德國(guó)GFL公司；J-E冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；Centrifuge 5417C微型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；MB-102恒溫振蕩金屬浴 日本Bioer公司；C130-1230V 手掌離心機(jī) 美國(guó)Labnet公司；NanoDrop 1000 微量紫外-分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司；AQE-183-2 全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 英國(guó)Syngene公司；LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取方法

1.3.1.1 Bayer公司的方法[11]

取2g大豆粉末放入50mL離心管中，加入10mL提取緩沖液，加入0.7mL 20% SDS，混勻后60℃溫育30min，期間不斷晃動(dòng)。待材料冷卻至室溫后8000×g離心5min，吸取1mL上清液至新的離心管中，按比例調(diào)整各試劑用量，用氯仿代替苯酚，進(jìn)行DNA提取，最后用100μL 0.2×TE緩沖液溶解DNA。

1.3.1.2 DuPont公司的方法[12]

取2g大豆粉末放入50mL離心管中，加入10mL十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)裂解緩沖液和20μL Proteinase K (20mg/mL)，混勻后60℃溫育2h，期間不斷晃動(dòng)。待材料冷卻至室溫后8000×g離心5min，吸取1mL上清液至新的離心管中，用氯仿代替苯酚，進(jìn)行DNA提取，最后用100μL 0.2×TE緩沖液溶解DNA。

1.3.1.3 Monsanto公司的方法[13]

取2g大豆粉末放入50mL離心管中，加入10mL溶液，包括9.8mL事先加熱的CTAB裂解緩沖液、0.2mL β-巰基乙醇和50μL Proteinase K(20mg/mL)，混勻后60℃溫育1h，期間不斷振搖。待材料冷卻至室溫后8000×g離心5min，吸取1mL上清液至新的離心管中，按比例調(diào)整各試劑用量，用氯仿代替苯酚，進(jìn)行DNA提取，最后用100μL 0.2×TE緩沖液溶解DNA。

1.3.1.4 Qiagen試劑盒提取方法

取2g大豆粉末放入50mL離心管中，加入10mL AP1溶液和30μL Proteinase K(20mg/mL)，混勻后60℃溫育1h，期間不斷晃動(dòng)。待材料冷卻至室溫后8000×g離心5min，吸取500μL上清液至新的離心管中，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行DNA提取，最后用100μL AE緩沖液洗脫。

1.3.1.5 Tiangen試劑盒提取方法

取2g大豆粉末放入50mL離心管中，加入6mL LP1溶液和50μL Proteinase K(20mg/mL)，混勻后60℃溫育30min，期間不斷晃動(dòng)。待材料冷卻至室溫后8000×g離心5min，吸取400μL上清液至新的離心管中，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行DNA提取，最后用100μL TE緩沖液洗脫。

1.3.2 DNA純度、得率的檢測(cè)

用NanoDrop1000微量紫外-分光光度計(jì)測(cè)定樣品液的純度及質(zhì)量濃度。DNA的純度取決于A260/A280、A260/A230的大?。籇NA質(zhì)量濃度由DNA模板在260nm波長(zhǎng)處的吸光度決定，A260=1時(shí)DNA質(zhì)量濃度為50ng/μL[14]。DNA得率用q測(cè)驗(yàn)進(jìn)行多重比較，DNA得率根據(jù)下式計(jì)算：

1.3.3 DNA分子質(zhì)量和完整性的檢測(cè)

用1×TAE溶液配制1%的瓊脂糖凝膠，EB染料加入瓊脂糖凝膠中。取10μL DNA溶液與2μL 6×Loading Buffer混合后點(diǎn)樣。然后在80V恒定電壓條件下進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間60min。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠塊置于凝膠成像系統(tǒng)中，觀察、拍攝電泳圖譜并進(jìn)行分析。

1.3.4 DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的適應(yīng)性檢測(cè)

取DNA溶液以及相應(yīng)的10倍稀釋液作為模板，對(duì)大豆內(nèi)源基因lectin進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，并設(shè)置空白對(duì)照。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19495.5—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)：核酸定量PCR方法》合成lectin基因特異性的引物和探針見表1。優(yōu)化的反應(yīng)體系見表2，DNA樣品的10倍稀釋液與原液加入相同的體積進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。優(yōu)化后反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃反應(yīng)10min，1個(gè)循環(huán)體系為95℃反應(yīng)15s，59℃反應(yīng)1min同時(shí)收集熒光，共進(jìn)行55個(gè)循環(huán)。

表 1 設(shè)計(jì)的引物、探針Table 1 Primers and probe of real-time fluorescent PCR amplification of lectin

表 2 lectin基因的TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系Table 2 Reaction system of real-time fluorescent PCR amplification of lectin

2 結(jié)果與分析

2.1 5種提取方法的DNA純度與得率

表 3 5種方法提取大豆DNA純度、得率比較Table 3 Purity and yield of DNA from soybean with five methods

上述5種提取方法均能從大豆中提取出DNA，但由表3可知，提取效果有明顯差異。由每種方法重復(fù)2次所得數(shù)據(jù)的平均值，對(duì)大豆子粒而言，采用Bayer法、Monsanto法提取DNA的A260/A280、A260/A230均較小，表明存在蛋白質(zhì)、多糖、鹽等雜質(zhì)，所提取的DNA純度不高；采用DuPont法提取的DNA的A260/A280接近1.7，A260/A230＜2.0，表明所提取的DNA去除蛋白質(zhì)效果較好但是仍有蛋白質(zhì)殘留，并且存在多糖、鹽等雜質(zhì)；Tiangen試劑盒法提取DNA的A260/A280在1.7～1.9之間，A260/A230＜2.0，表明所提取的DNA中殘存多糖、鹽和小分子雜質(zhì)等；采用Qiagen試劑盒法提取的DNA的A260/A280＞1.9，A260/A230＞2.0，表明DNA樣品中有RNA。就DNA得率而言，Bayer法的DNA得率顯著高于其他4種方法(P＜0.05)，Qiagen試劑盒法的DNA得率顯著高于Tiangen試劑盒法、DuPont法與Monsanto法(P＜0.05)，Tiangen試劑盒法與DuPont法的DNA得率差異不顯著(P＞0.05)，Monsanto法的DNA得率最低，且與其他方法差異顯著(P＜0.05)。綜合考慮DNA純度與得率，Qiagen試劑盒法、Tiangen試劑盒法與DuPont法效果較好，Monsanto法與Bayer法效果較差。

2.2 5種提取方法的DNA完整性

圖 1 5種方法提取的DNA凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of DNA with five methods

DNA樣品瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖1。Bayer法、DuPont法、Qiagen試劑盒法、Tiangen試劑盒法均可提取出DNA，其片段大于23kb，RNA降解較為完全，提取得到的DNA完整性較好。從圖1還可以看出，雖然電泳上樣量相同，但DNA條帶亮度有較大區(qū)別：Bayer法提取的DNA樣品，通過260nm時(shí)的吸光度計(jì)算，判斷其得率最高，但在電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)其DNA條帶亮度較低、點(diǎn)樣孔較亮且主帶下方有拖帶現(xiàn)象，說明在樣品中存在蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)的污染；DuPont法、Qiagen試劑盒法、Tiangen試劑盒法提取的DNA條帶明亮；Monsanto法提取出DNA經(jīng)電泳未觀察到明顯的條帶。因此，DuPont法、Qiagen試劑盒法、Tiangen試劑盒法提取的DNA純度高、產(chǎn)率高、完整性好。

2.3 大豆lectin基因的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增

以5種方法提取的DNA樣液與其10倍稀釋液取等體積液體作為DNA擴(kuò)增模板，對(duì)大豆內(nèi)源基因lectin進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。

圖 2 DNA與其10倍稀釋液的lectin基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Fluorescent PCR amplification of lectin using DNA and 10-fold dilution as template

由圖2可知，除了以Monsanto法提取的DNA為模板的擴(kuò)增沒有特征圖譜外，Bayer法、DuPont法、Qiagen試劑盒法與Tiangen試劑盒法提取的DNA與其10倍稀釋液為模板擴(kuò)增均得到典型的擴(kuò)增對(duì)數(shù)圖譜，說明使用Monsanto法提取大豆的DNA不適合進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。

對(duì)數(shù)圖譜反映的是熒光量的對(duì)數(shù)與PCR循環(huán)次數(shù)的關(guān)系，指數(shù)擴(kuò)增階段PCR產(chǎn)物隨循環(huán)數(shù)指數(shù)增長(zhǎng)且擴(kuò)增效率穩(wěn)定，熒光量等比例增長(zhǎng)[15]，因此指數(shù)擴(kuò)增階段熒光量的對(duì)數(shù)隨循環(huán)數(shù)呈線性增加，其斜率與擴(kuò)增效率正相關(guān)。由圖2A可見，Bayer法提取的DNA在指數(shù)擴(kuò)增階段時(shí)熒光量對(duì)數(shù)的增長(zhǎng)明顯較10倍稀釋液的平緩，說明Bayer法提取得到的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR的擴(kuò)增效率較10倍稀釋液的低，故使用Bayer法提取得到的DNA中存在雜質(zhì)，抑制實(shí)時(shí)熒光PCR的擴(kuò)增；由圖2B、2D與2E可見，DuPont法、Qiagen試劑盒法和Tiangen試劑盒法提取的DNA與其10倍稀釋液的擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長(zhǎng)期的平行性良好，說明使用DuPont法、Qiagen試劑盒法、Tiangen試劑盒方法提取得到的DNA無明顯抑制實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的雜質(zhì)存在。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以大豆子粒為材料，研究Bayer、DuPont、Monsanto公司提供的3種大豆DNA提取方法以及國(guó)外的Qiagen試劑盒法、國(guó)內(nèi)的Tiangen試劑盒法提取DNA的效果，旨在優(yōu)選出簡(jiǎn)便、快速、有效的大豆DNA 提取方法。根據(jù)檢測(cè)工作的實(shí)際需要，各方法使用2g大豆粉作為DNA提取樣品，以保證抽取樣品具有較好的代表性。由于大豆粉樣品用量的增加，Qiagen和Tiangen試劑盒法增加蛋白酶用于去除過多的蛋白以減少干擾。此外，Bayer法、DuPont法、Monsanto法使用氯仿代替苯酚進(jìn)行抽提去除雜質(zhì)，避免苯酚殘留使DNA降解以及對(duì)后續(xù)PCR所造成的抑制[16]。

Bayer法使用SDS使染色體離析、蛋白質(zhì)變性，并與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合成復(fù)合物沉淀，釋放出DNA，DNA得率最高，但是DNA純度最差，表明用SDS提取DNA時(shí)會(huì)吸附較多雜質(zhì)，這與張偉等[17]的研究結(jié)果類似。DuPont和Monsanto法均使用CTAB陽離子去污劑使蛋白質(zhì)變性，并與蛋白質(zhì)和多糖形成復(fù)合物，釋放DNA，瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示DNA較完整，但是兩種方法在DNA純度與得率上存在較大差異：DuPont法通過氯仿抽提、鹽溶液的濃度變化去除雜質(zhì)，能提取到較高質(zhì)量的DNA，與Mafra等[18]的研究結(jié)果相似；Monsanto法與王振東等[19]的方法相比，氯仿抽提次數(shù)少、多次使用醇類沉淀DNA，造成提取到的DNA雜質(zhì)含量多且損失過多，因此純度差且得率最低，不過此方法可取之處是裂解緩沖液中加入抗氧化劑β-巰基乙醇，能防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除[16]。Qiagen試劑盒法使用雜質(zhì)去除離心柱與核酸吸附離心柱來提取純化DNA，Tiangen試劑盒法使用核酸吸附離心柱提取DNA，兩種方法均能提取到較高質(zhì)量的DNA。因此DuPont法、Qiagen試劑盒法與Tiangen試劑盒法能夠提取到純度好、得率高、完整性較好的DNA。

核酸檢測(cè)技術(shù)中實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為應(yīng)用范圍最廣泛并且成熟的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)平臺(tái)[20]。試驗(yàn)中取DNA溶液以及相應(yīng)的10倍稀釋液作為模板，對(duì)大豆內(nèi)源基因lectin進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)DNA對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR的適應(yīng)性。結(jié)果表明：Monsanto法提取的DNA得率過低不能得到很好的擴(kuò)增；Bayer法、DuPont法、Qiagen試劑盒法與Tiangen試劑盒法提取的DNA均能擴(kuò)增出目的片段，但是Bayer法提取的DNA含有較多的實(shí)時(shí)熒光PCR抑制劑，如多糖、酚類等，影響實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果準(zhǔn)確性。因此，DuPont法、Qiagen試劑盒法與Tiangen試劑盒法提取的DNA能夠用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

轉(zhuǎn)基因大豆的實(shí)際檢測(cè)工作中，要求DNA提取方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、快捷。Bayer法耗時(shí)至少8h，DuPont法需要5h左右，Monsanto法需要7h左右，DuPont法用時(shí)短、步驟簡(jiǎn)便，比起另外兩種方法更適合在實(shí)際檢測(cè)工作中應(yīng)用。試劑盒法均用時(shí)短，1～2h內(nèi)便可完成DNA提取工作，但是需要一定的成本支出，Qiagen試劑盒平均提取一個(gè)樣品DNA花費(fèi)40元，成本過高，不適合在我國(guó)大范圍推廣；Tiangen試劑盒平均提取一個(gè)樣品DNA花費(fèi)10元，具有較高的性價(jià)比，適用于實(shí)際檢測(cè)工作。

綜上所述，5種方法中DuPont法和Tiangen試劑盒法所提取的DNA純度好、得率高、完整性較好，含有較少抑制因子，幾乎對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)無影響，且操作簡(jiǎn)便、性價(jià)比較高，適用于大豆DNA提取。其中Tiangen試劑盒法用時(shí)較短，但成本稍高。在實(shí)際檢測(cè)工作中，應(yīng)根據(jù)檢測(cè)任務(wù)的緊急情況和成本，有針對(duì)性地選擇合適的大豆DNA提取方法。

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