葉 飛，高士偉,2，龔自明,2,*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所，湖北 武漢 430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心果茶分中心，湖北 武漢 430064)

茶是世界三大無酒精飲料之一，近年來隨著社會(huì)進(jìn)步和科學(xué)發(fā)展，人們對(duì)茶及茶飲品更加重視，飲茶有益于身體健康[1-2]。2011年全球茶葉消費(fèi)約為400萬t，其中紅茶約占75%[3]，而發(fā)酵是紅茶最重要的加工工序，對(duì)品質(zhì)的形成起到了關(guān)鍵性作用，發(fā)酵過程中茶葉中的兒茶素及多酚類化合物被多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)酶促氧化，生成了茶黃素(theaflavins，TF)與茶紅素(thearubigins，TR)等色素物質(zhì)，形成了干茶烏黑油潤(rùn)，湯色紅艷明亮，香高濃烈，滋味濃醇甘甜，葉底紅亮的特征[4]。

近年來相關(guān)研究通過改進(jìn)傳統(tǒng)加工工藝提高紅茶發(fā)酵品質(zhì)，如方世輝等[5]對(duì)發(fā)酵溫度、時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，茶黃素和茶紅素的含量得到了提高；楊春等[6]利用烏龍茶品種的鮮葉試制紅茶，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間對(duì)干茶的生化成分和品質(zhì)影響較大；賴兆祥等[7]在紅茶加工中引入了做青技術(shù)，并對(duì)發(fā)酵時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，所制的紅茶具有天然花香且品質(zhì)優(yōu)異；譚俊峰等[8]對(duì)茶鮮葉進(jìn)行超高壓技術(shù)處理后，所制的紅茶的生化成分顯著改善且品質(zhì)明顯提高。在紅茶加工添加枇杷葉、藍(lán)莓等天然產(chǎn)物[9-11]促進(jìn)夏秋紅茶發(fā)酵，提高了TF含量并改善了紅茶的口感；谷記平[12]、王坤波[13]等利用砂梨的多酚氧化酶將茶多酚中的兒茶素酶促合成了茶黃素，說明不同的來源的多酚氧化酶可以作用于同一底物并合成紅茶中的茶黃素等物質(zhì)。夏秋茶鮮葉中的茶多酚等苦澀味物質(zhì)較多，所制綠茶苦澀，導(dǎo)致鮮葉資源浪費(fèi)嚴(yán)重；同時(shí)夏秋季砂梨資源比較豐富，且砂梨的多酚氧化酶又能有效地將茶多酚酶促合成茶黃素等物質(zhì)，本研究利用砂梨的多酚氧化酶促進(jìn)夏秋紅茶發(fā)酵，并對(duì)所制干茶的滋味、色澤和香氣成分進(jìn)行比較分析，旨在為紅茶加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶鮮葉：采摘于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所的茶園，2010—2012年7—9月的福云6號(hào)品種的一芽二葉；其他試劑按國(guó)標(biāo)執(zhí)行。

1.2 儀器與設(shè)備

6CR-40茶葉揉捻機(jī) 浙江上洋公司；UV-5100分光光度計(jì) 日本日立公司；CM-5色差計(jì) 美能達(dá)公司；TRACE GC 2000聯(lián)TRACE DSQ型GC-MS 美國(guó)熱電公司。

1.3 方法

以統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的鮮葉為原料，以鮮葉萎凋→揉捻→添加砂梨的多酚氧化酶的粗酶液→發(fā)酵→干燥為工藝路線，其中鮮葉統(tǒng)一萎凋(日光萎凋15～20min，室外40.9℃，相對(duì)濕度40.3%，室內(nèi)萎凋18h，室內(nèi)25～34℃，相對(duì)濕度45%～60%)，統(tǒng)一揉捻1h并分成5份，統(tǒng)一進(jìn)行發(fā)酵，具體處理見表1，后續(xù)干燥制成紅茶(毛火120℃，20min；足火75℃，1h)，最后進(jìn)行感官品質(zhì)評(píng)審和生化成分測(cè)定。外源酶的粗酶液提取：選取砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)中豐水品種的果肉，搗碎勻漿5min，4℃、8000r/min離心30min，上清液為多酚氧化酶粗酶液，多酚氧化酶粗酶液與揉捻葉的質(zhì)量之比依次設(shè)定為0%、3%、5%、10%和15%(表1)。

表 1 砂梨多酚氧化酶促進(jìn)紅茶發(fā)酵處理設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design for improving black tea manufacture by prefermentation addition of the polyphenol oxidase from Pyrus pyrifolia Nakai

1.4 指標(biāo)測(cè)定

多酚氧化酶活性：測(cè)定方法按文獻(xiàn)[13]進(jìn)行；茶葉感官品質(zhì)：對(duì)茶樣進(jìn)行密碼感官審評(píng)(GB/T 23776—2009《茶葉感官審評(píng)方法》)，內(nèi)質(zhì)得分=湯色×10%＋香氣×25%＋滋味×30%＋葉底×10%；茶多酚(tea polyphenol，TP)：GB8313—1987《酒石酸鐵比色法》；氨基酸：GB8314—1987《茚三酮比色法》；干茶和茶湯色澤：色差法測(cè)定(光源D65，角度4°)，湯色采取3g茶葉加150mL沸水沖泡4min，過濾后用專用比色皿測(cè)定[14]；茶黃素、茶紅素和茶褐素：采用羅勃茲改進(jìn)法；黃酮類測(cè)定：三氯化鋁比色法[15]；香氣成分：采用SPME-GC/MS分析測(cè)定，GC-MS按照相關(guān)方法[16]進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel和SPSS13.0處理，大寫字母和小寫字母分別表示Duncan’s新復(fù)極差(SSR)在P=0.01和P=0.05水平下的差異顯著性，字母不同表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 砂梨和茶葉多酚氧化酶活性比較

圖 1 茶葉與砂梨的多酚氧化酶活性比較Fig.1 Comparison of polphenol oxidase activity between Pyrus pyrifolia Nakai and tea

由圖1可知，在pH5.5和25℃條件下，砂梨和茶葉的PPO活性曲線分別在110s和1200s呈直線關(guān)系，吸光度分別為0.467和0.478，計(jì)算得出砂梨和茶葉的酶活力分別為254.72U/mL和23.9U/mL，說明不同來源的多酚氧化酶動(dòng)力學(xué)曲線差異極大，砂梨在3min左右時(shí)達(dá)到了最大反應(yīng)速率，茶葉在20min左右才達(dá)到了最大反應(yīng)速率，所以砂梨的多酚氧化酶活性較強(qiáng)。

2.2 砂梨多酚氧化酶促進(jìn)發(fā)酵對(duì)紅茶品質(zhì)的影響

2.2.1 砂梨多酚氧化酶促進(jìn)發(fā)酵對(duì)紅茶感官內(nèi)質(zhì)的影響

表 2 砂梨多酚氧化酶促進(jìn)發(fā)酵對(duì)紅茶內(nèi)質(zhì)的影響Table 2 Effects of pre-fermentation addition of polyphenol oxidase on the sensory quality of black tea

由表2可知，處理3的得分最高(67.95分)，處理4其次(67.70分)，對(duì)照最低(65.70分)，可見砂梨PPO的粗酶液與揉捻葉的質(zhì)量之比在0%～10%范圍內(nèi)，隨著比例的升高，夏秋紅茶品質(zhì)明顯改善(r = 0.9375)，且比例為10%(處理3)時(shí)內(nèi)質(zhì)得分最高(67.95分)。

2.2.2 不同處理對(duì)湯色和葉底的影響

由表2可知，處理3的湯色表現(xiàn)最好，得分最高(92分)，處理4的湯色次之(91分)，而處理1～4的湯色都比對(duì)照要好，可能是適度的酶促反應(yīng)有利于改善湯色，而酶促反應(yīng)太劇烈時(shí)，湯色下降。處理3、4的葉底得分較高(90分)，可能是適當(dāng)?shù)拿复傺趸淖兞巳~底的葉綠素等成分比例，導(dǎo)致葉底和茶湯顏色發(fā)生了改變。

2.2.3 不同處理對(duì)紅茶香氣和滋味的影響由表2可知，處理3的香氣(91分)和滋味(91分)得分最高，說明砂梨多酚氧化酶與揉捻葉的質(zhì)量比例為10%時(shí)，夏秋紅茶品質(zhì)的改善作用最為明顯，可能是過少的多酚氧化酶對(duì)夏秋紅茶中茶多酚類的氧化程度不夠，而過多的氧化又會(huì)使發(fā)酵過度，使紅茶滋味變淡，香氣變低。

2.3 不同處理對(duì)紅茶色澤的影響比較

表 3 砂梨多酚氧化酶促進(jìn)發(fā)酵對(duì)紅茶色澤的影響Table 3 Effects of pre-fermentation addition of polyphenol oxidase on color parameters of black tea

由表3可知，紅茶要求干茶的色澤烏黑油潤(rùn)、茶湯的湯色紅艷明亮，對(duì)干茶和茶湯的亮度(L*)和色相(a*/b*)要求較高。與對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)組的干茶亮度(L*)變化不大，而干茶色相出現(xiàn)不同程度的下降，可能是因?yàn)槎喾友趸复龠M(jìn)了發(fā)酵，同時(shí)干茶色相值下降；處理1、2的茶湯色相值(a*/b*)明顯提高(P＜0.01)，處理3、4的茶湯亮度明顯提高(P＜0.01)，色相值下降，與相關(guān)研究結(jié)論一致[17]?？赡苁巧倭康纳袄娑喾友趸柑岣吡伺c茶湯亮度正相關(guān)的茶黃素含量，而過多的多酚氧化酶可能會(huì)使茶黃素進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成導(dǎo)致茶湯發(fā)暗的茶褐素等其他物質(zhì)，所以茶湯色澤出現(xiàn)先升后降的走勢(shì)。

2.4 不同處理對(duì)紅茶內(nèi)含成分的影響

表 4 砂梨多酚氧化酶促進(jìn)發(fā)酵對(duì)紅茶內(nèi)含成分的影響Table 4 Effects of pre-fermentation addition of polyphenol oxidase on components of black tea

紅茶發(fā)酵產(chǎn)生的茶黃素、茶紅素和酚氨比等是決定品質(zhì)的重要物質(zhì)，茶黃素(TF)是紅茶茶湯亮度、香味的鮮爽度和濃烈度的重要因素。茶紅素(TR)是茶湯濃度為主體，收斂性較弱，刺激性小。茶黃素與茶紅素比例適當(dāng)才能形成優(yōu)良的品質(zhì)，而茶褐素(TB)較多時(shí)不利于紅茶的品質(zhì)。由表4可知，處理3的TF/TR比例適中，茶褐素含量處于適當(dāng)水平，同時(shí)酚氨比降低(P＜0.05)，黃酮類含量較少(P＜0.01)。

2.5 不同處理對(duì)紅茶香氣組分含量的影響

表 5 砂梨多酚氧化酶促進(jìn)發(fā)酵對(duì)紅茶香氣的影響Table 5 Effects of pre-fermentation addition of polyphenol oxidase on aroma compounds of black tea

感官評(píng)價(jià)認(rèn)為外源酶處理的成品茶香氣得到了明顯改善，進(jìn)行香氣組分分析，結(jié)果如表5所示，并對(duì)香氣得分最高的處理3和對(duì)照進(jìn)行了圖譜(圖2)比較。其中部分香氣組分經(jīng)砂梨多酚氧化酶處理后含量明顯升高，如β-紫羅酮、橙花醇、α-古巴烯、反-香葉基丙酮、反-橙花叔醇、順-己酸-3-己烯酯、十四烷、α-雪松醇、十六烷、2,3-環(huán)氧-β-紫羅酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、二丁基四氫噻吩、十六酸甲酯，其中β-紫羅酮具有木香和水果香，比α-紫羅酮更為鮮明的柏木香韻，對(duì)紅茶香氣有重要作用[18]；部分香氣組分經(jīng)砂梨多酚氧化酶處理后含量先升后降，如苯乙醇、苯乙醛、苯甲醛、苯甲醇、藏紅花醛、反-2-己烯己酸酯等，其中苯甲醇在祁紅茶中含量較高[19]；而部分香氣組分經(jīng)砂梨多酚氧化酶處理后含量明顯降低，如β-芳樟醇、壬醛、水楊酸甲酯、2-苯基丁烯2-醛、2-乙酰吡咯、反-2-癸烯醛、4-甲基-2-苯基戊烯-2-醛、1-甲基萘、2-十一烯醛、5-甲基-2-苯基己烯-2-醛、N-乙基琥珀酰亞胺。處理3與對(duì)照相比，β-紫羅酮含量由對(duì)照樣的6.06%上升到6.70%；橙花醇的含量由2.80%上升到3.44%；α-古巴烯由2.20%上升到2.49%；2,4-二甲基苯甲醛由1.76%上升到1.91%；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚由0.92%上升到1.63%；反-香葉基丙酮由1.49%上升到1.70%；β-羥基-十二烷酸由0.49%上升到1.98%；反-橙花叔醇由0.51%上升到0.81%；順-己酸-3-己烯酯由1.32%上升到1.62%；藏紅花醛由2.00%上升到2.18%；十四烷由0.87%上升到1.36%；α-雪松醇由0.62%上升到0.83%；2,3-環(huán)氧-β-紫羅酮由0.77%上升到1.09%；二氫獼猴桃內(nèi)酯由1.64%上升到1.77%；十六酸甲酯由2.98%上升到5.65%。

圖 2 對(duì)照樣(a)和處理3樣品(b)香氣組分圖譜Fig.2 GC-MS chromatograms of aroma components in control sample(a) and treatment No. 3 (b)

3 討論與結(jié)論

紅茶發(fā)酵是以多酚類化合物氧化為核心的過程，兒茶素類被酶促氧化形成茶黃素、茶紅素及茶褐素，并促進(jìn)氨基酸、胡蘿卜素等發(fā)生偶聯(lián)氧化形成香氣化合物，形成了紅茶獨(dú)特的風(fēng)味[20]。相關(guān)研究[8]發(fā)現(xiàn)：鮮葉經(jīng)過超高壓處理后，多酚氧化酶以與底物得以充分接觸，紅碎茶的感官品質(zhì)和香氣都得到了提高。而多酚氧化酶廣泛存在于自然界中，且不同來源的多酚氧化酶可以作用于相同的底物，研究[9-11,21]證實(shí)不同的外源酶可以作用同一底物，并可合成紅茶的茶黃素和茶紅素，并改善茶葉的口感。

3.1 本研究利用砂梨多酚氧化酶促進(jìn)夏秋紅茶發(fā)酵發(fā)現(xiàn)：砂梨的多酚氧化酶促進(jìn)了紅茶發(fā)酵，夏秋紅茶品質(zhì)得到了明顯提高，感官評(píng)審的結(jié)果顯示，砂梨多酚氧化酶粗酶液與揉捻葉的質(zhì)量之比為10%時(shí)，紅茶感官得分最高，新工藝所制的紅茶湯色紅艷明亮，葉底紅亮，滋味醇厚爽口，香氣甜香持久。

3.2 砂梨的多酚氧化酶改善了紅茶色澤，實(shí)驗(yàn)處理1和處理2的茶湯色相值(a*/b*)明顯提高(P＜0.01)，處理3和處理4的茶湯亮度顯著提高(P＜0.01)，色相值也顯著下降(P＜0.01)，說明新工藝所制紅茶的茶湯更加紅亮。

3.3 砂梨的多酚氧化酶改善了茶湯內(nèi)質(zhì)，與對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)處理4所制的干茶中的茶黃素(TF)/茶紅素(TR)的比值上升了86.05%，可溶性糖含量明顯上升(34.34%)，黃酮類等苦澀味物質(zhì)減少了7.94%；酚氨比值也降低了3.96%，說明茶湯的可溶性糖等甜醇類物質(zhì)增多，同時(shí)苦澀味的黃酮類物質(zhì)減少，夏秋紅茶的口感得到了改善。

3.4 砂梨多酚氧化酶也改善了紅茶香氣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：砂梨多酚氧化酶處理過的夏秋紅茶部分香氣組分明顯升高，如β-紫羅酮、橙花醇、α-古巴烯、反-香葉基丙酮、反-橙花叔醇、順-己酸-3-己烯酯、十四烷、α-雪松醇、十六烷、2,3-環(huán)氧-β-紫羅酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、二丁基四氫噻吩、十六酸甲酯。

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