張 翠，趙艷敏，白淑芳，劉岱琳，*

(1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院生藥教研室，天津市職業(yè)與環(huán)境危害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300162;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193)

麥角硫因(巰基組氨酸三甲基內(nèi)鹽，ergothioneine，EGT)是1909 年在麥角中發(fā)現(xiàn)的一種稀有化合物［1］。它是機(jī)體內(nèi)的重要活性物質(zhì)，但不能由動(dòng)物機(jī)體自身合成，只能從食物中攝取。麥角硫因具有清除自由基、維持DNA 的生物合成、細(xì)胞的正常生長(zhǎng)及細(xì)胞免疫等多種生理功能［2-6］，可用于開(kāi)發(fā)戶外護(hù)膚產(chǎn)品，防護(hù)性的化妝品［7-8］以及眼科產(chǎn)品，谷胱甘肽理想的替代品等［9］，已漸漸得到更多人的關(guān)注。目前麥角硫因的獲得方式主要有化學(xué)合成和天然來(lái)源的分離［10-12］。但是化學(xué)合成的麥角硫因由于存在副產(chǎn)物等其他雜質(zhì)而束縛了其在食品、藥品與保健品領(lǐng)域中的應(yīng)用。上世紀(jì)90 年代日本學(xué)者從日本側(cè)耳(Ampteramyces japonicus)的子實(shí)體中分離得到麥角硫因［13］。這是首次從蘑菇中分離到該化合物。后續(xù)很多學(xué)者開(kāi)始著力研究麥角硫因的分離研究［14-16］。麥角硫因的國(guó)外研究報(bào)道較多，而國(guó)內(nèi)還處于探索階段。我國(guó)的真菌資源比較豐富，目前測(cè)定麥角硫因含量的研究很少，國(guó)外曾報(bào)道過(guò)利用C18色譜柱對(duì)杏鮑菇及靈芝中的麥角硫因進(jìn)行測(cè)定［17-18］，國(guó)內(nèi)也有學(xué)者采用C18 色譜柱測(cè)定了雙孢菇中麥角硫因的含量［19］。麥角硫因是一種稀有氨基酸，而如今對(duì)氨基酸的測(cè)定多采用氨基色譜柱，國(guó)內(nèi)有人利用氨基色譜柱測(cè)定了紅棗、苜蓿芽等食品中多種氨基酸的含量［20-21］。我們?cè)谖墨I(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上結(jié)合麥角硫因的性質(zhì)，首次建立了用氨基色譜柱測(cè)定麥角硫因的HPLC 檢測(cè)方法，對(duì)產(chǎn)自天津、山東、東北三省地區(qū)的10 種蘑菇中麥角硫因的含量進(jìn)行測(cè)定，麥角硫因的資源調(diào)查和蘑菇的進(jìn)一步合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10 種蘑菇樣品分別為產(chǎn)自天津的平菇(Pleurotus ostreatus(Fr.)Kummer)、雞腿菇(Copyinds comatus (MUII. Fr)Gray)、金針菇(Flammulina velutiper(Fr.)Sing)、海鮮菇(Hypsizygus marmoreus(Peck)H.E.Bigelow)、口蘑(Tricholomagambosum)，產(chǎn)自山東的白玉菇(Hypsizygus marmoreus(pk)Sing)，(以上均為鮮蘑菇)產(chǎn)自吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)的松蘑(Suillusluteus (L.exFr.) GrayBoletusluteu )、榛蘑(Armillaria mellea (Vahl ex Fr.)Quel)、猴頭菇(Hericium erinaceus)和遼寧省鐵嶺地區(qū)的白蘑(Tricholoma mongolicum Imai)。(以上均為干蘑菇);麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品，含量98% 天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;乙腈為色譜級(jí);純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司;其他試劑均為分析純。

高效液相色譜儀(泵型號(hào)LC-20AT、檢測(cè)器SPDM20A) 日本Shimadzu 公司;MT5 電子天平瑞士梅特勒-托利多公司;HH-2 數(shù)字顯示恒溫水浴鍋 常州市國(guó)華儀器有限公司;KQ5200E 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;DHG-9000A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與曲線繪制 精密稱(chēng)取麥角硫因?qū)φ掌愤m量，置于10mL 棕色容量瓶中，用色譜甲醇定容，搖勻，即得麥角硫因?qū)φ掌啡芤?0.1060mg/mL)。分別取上述對(duì)照品溶液0.5、2.5、5.0、7.5、10.0mL，置于10mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容后進(jìn)行HPLC 測(cè)定。

1.2.2 待測(cè)樣品前處理 稱(chēng)取不同品種干蘑菇各2.5g、鮮蘑菇各8.0g 于100mL 容量瓶中，加入80mL去離子水，于100℃水浴鍋中加熱回流提取1h，冷卻至室溫，用去離子水定容，搖勻，用0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試品溶液，于冰箱中冷藏保存。

1.2.3 樣品水分含量測(cè)定［22］取粉碎成0.5cm ×0.5cm 的蘑菇樣品各2g，平鋪于干燥恒重的扁形稱(chēng)量瓶中，精密稱(chēng)定，打開(kāi)瓶蓋在100～105℃干燥5h。將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30min，精密稱(chēng)定，再在上述溫度干燥1h，冷卻稱(chēng)重，至連續(xù)兩次稱(chēng)重的差異不超過(guò)5mg 為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算樣品中的水分含量(%)，平行三次，求平均值。

1.2.4 色譜條件 色譜柱:Kromasil 100-5NH2柱(250mm ×4.60mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈-5mmol/L 醋酸銨(80∶20);流速:1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL。

1.2.5 樣品含量測(cè)定 各樣品按1.2.2 項(xiàng)下方法制備，平行三次實(shí)驗(yàn)，測(cè)定各供試品峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算供試品中麥角硫因的濃度C(mg/mL)，利用計(jì)算公式計(jì)算各樣品的含量。將各樣品質(zhì)量M(mg)和水分含量W(%)代入如下公式，計(jì)算得到各樣品的麥角硫因含量。

式中:C:供試品中麥角硫因的濃度(mg/mL);V=100mL;M:各樣品的質(zhì)量(mg);W:各樣品的水分含量(%)

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

本研究發(fā)現(xiàn)，麥角硫因在254nm 處有最大吸收，實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相考察了不同比例乙腈-5mmol/L 醋酸銨(85∶15)，乙腈-5mmol/L 醋酸銨(80∶20)，乙腈-5mmol/L 醋酸銨(90∶10)等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈-5mmol/L 醋酸銨(80∶20)時(shí)，麥角硫因與樣品中其他雜質(zhì)能達(dá)到良好的分離效果，麥角硫因的保留時(shí)間為12.7min，標(biāo)準(zhǔn)圖譜見(jiàn)圖1(A)。按照色譜峰的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法峰面積定量，口蘑樣品的圖譜見(jiàn)圖1(B)。

圖1 麥角硫因?qū)φ掌?A)及口蘑樣品(B)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of ergothioneine standard and sample

2.2 麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)曲線

在規(guī)定色譜條件下，將標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液進(jìn)樣20μL 進(jìn)行測(cè)定，以峰面積Y 對(duì)麥角硫因的質(zhì)量濃度X(mg/mL)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示麥角硫因在0.005～0.106mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積相關(guān)性較好，回歸方程為:Y =4.69 ×107X-67186，R2=0.9999。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，測(cè)得平均峰面積為5037662，RSD =0.18%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取處理后的白蘑樣品分別于0、2、4、6、8、12h 各進(jìn)樣一次，測(cè)得平均峰面積為528038，RSD =1.01%，表明在12h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取白蘑柄樣品5 份，每份2.5g，按1.2.2 項(xiàng)下方法制備，依方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出該樣品麥角硫因的平均含量為0.055%，RSD =0.90%，表明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知麥角硫因含量的白蘑柄樣品2.5g，分別加入相當(dāng)于樣品中麥角硫因含量的80%、100%、120%的對(duì)照品溶液，按1.2.2 項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，供試品溶液進(jìn)行HPLC 測(cè)定。結(jié)果顯示回收率良好，如表4。

表1 精密度考察結(jié)果Table 1 The result of precision tests

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 2 The result of stability tests

表3 重復(fù)性考察結(jié)果Table 3 The result of repeatability tests

表4 麥角硫因加樣回收率結(jié)果Table 4 The addition recovery of ergothioneine

表5 多種蘑菇中水分含量的測(cè)定(n=3)Table 5 The moisture contents of different mushrooms(n=3)

表6 不同品種及不同部位蘑菇中麥角硫因的含量測(cè)定(n=3)Table 6 The contents of ergothioneine in different kinds of mushrooms(n=3)(1)

2.4 樣品水分含量測(cè)定

按1.2.3 項(xiàng)下測(cè)得各樣品的水分含量W(%)，結(jié)果如表5。

2.5 樣品含量測(cè)定

按1.2.5 項(xiàng)下測(cè)得各樣品的麥角硫因含量，結(jié)果如表6。

本實(shí)驗(yàn)選取了東北地區(qū)，天津和山東地區(qū)常見(jiàn)蘑菇為原料，并將幾種可以明確分辨?zhèn)愫捅哪⒐竭M(jìn)行分離，分為傘和柄兩種部位進(jìn)行麥角硫因的含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品種的蘑菇中麥角硫因含量差異較大，只有東北的松蘑中不含有麥角硫因，其余九種蘑菇中均不同程度含有麥角硫因。我們也對(duì)能夠明確辨識(shí)的蘑菇傘和柄分別測(cè)定麥角硫因的含量，結(jié)果顯示同種蘑菇的不同部位中麥角硫因含量也存在差異，尤其白蘑的蘑菇傘中不含有麥角硫因而蘑菇柄中卻含有。這可能與麥角硫因在真菌體內(nèi)合成過(guò)程有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

同時(shí)，因各蘑菇樣品的水分含量不同，尤其是新鮮的蘑菇中含有大量的水分，在室溫下儲(chǔ)藏時(shí)質(zhì)量極其不穩(wěn)定，所以1.2.2 項(xiàng)下稱(chēng)取的蘑菇質(zhì)量并不能代表其真實(shí)質(zhì)量，所以我們通過(guò)測(cè)定各樣品的水分含量，將各樣品的質(zhì)量折算成不含水分的蘑菇質(zhì)量，保證了含量測(cè)定的真實(shí)性、準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法建立了麥角硫因的含量測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏。實(shí)驗(yàn)中選自天津、山東及東北地區(qū)的10 種蘑菇材料，測(cè)得其中麥角硫因的含量，含量范圍在0.000%～0.280%之間。麥角硫因含量由高到低依次為:榛蘑傘＞金針菇＞口蘑＞雞腿菇傘＞海鮮菇＞白玉菇柄＞雞腿菇柄＞白蘑柄＞猴頭菇＞平菇＞榛蘑柄＞松蘑、白蘑傘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為蘑菇的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

此外對(duì)于含有麥角硫因的蘑菇也可以進(jìn)一步馴化蘑菇菌種，優(yōu)化培育條件，可以提高麥角硫因的含量，為其綜合開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。這些仍需要我們科研工作者進(jìn)行深入研究和探討。

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