郝利民，張國君，王宗臻，郝新敏，魯吉珂，3，張建春

(1.總后軍需裝備研究所軍用漢麻材料研究中心，北京100027;2.寧波宜科科技實業(yè)股份有限公司，浙江寧波315153;3.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450001)

漢麻(China-hemp)為木蘭綱(Magnoliopsida)蕁麻目(Rosales)大麻科(Cannabaceae)大麻屬(Cannabis)大麻種(Cannabis sativa L.)一年生草本植物，又稱大麻，線麻，火麻等［1］。漢麻可在丘陵、山坡、灘涂等荒地種植，不與糧、棉、油爭地，其抗自然災(zāi)害能力強(qiáng)，各種氣候均可實現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)［2］。漢麻全身都是寶，主要有紡織、食用和藥用三大功能。漢麻皮富含纖維，可用于服裝及各種飾品加工;漢麻桿芯是極佳的木材替代品，還可用來生產(chǎn)超微粉;漢麻籽富含優(yōu)質(zhì)蛋白以及人體必需脂肪酸，可應(yīng)用于食品、保健品等領(lǐng)域［3-5］;漢麻葉中富含多種活性物質(zhì)［1，6］，如大麻酚類、膽堿、齊墩果酸、齊墩果烯和黃酮類等。其中黃酮類化合物具有免疫激活、抗氧化、抗腫瘤、抑菌抗病毒、抗心腦血管疾病、降血壓等作用，具有較高的藥用價值［7-8］。目前總黃酮提取主要以銀杏葉為原料，前期初步分析表明，漢麻葉中總黃酮的含量也較高。從漢麻葉中提取總黃酮既可拓展植物黃酮的來源，也可提升漢麻加工品的附加值，完善漢麻產(chǎn)業(yè)鏈并有利于漢麻資源的綜合利用。目前，黃酮類化合物的提取方法主要有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、酶解法、超臨界流體萃取法、雙水相萃取分離法等［9］。超臨界流體萃取等方法雖然具有提取效率高、無溶劑殘留、無毒等優(yōu)點，但存在設(shè)備要求高，成本高等問題［10］。微波輔助提取法要考慮微波穿透物質(zhì)內(nèi)部時衰減的問題;溶劑萃取法選擇性高，產(chǎn)品收率高，但其提取時間較長，提取效率不高。本文分別采用乙醇溶劑法和超聲輔助法，對漢麻葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以探尋漢麻葉總黃酮的最適提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥漢麻葉 來自云南工業(yè)大麻股份有限公司;蘆丁標(biāo)品 購于中國藥品生物制品檢定所;乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 均為分析純。實驗動物 ICR 小鼠(20～24g)，雌雄各半(6 周齡)，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供。

KQ-500B 型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV-2450 型紫外可見分光光度計 日本島津公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 漢麻葉浸膏急性毒性實驗 漢麻葉浸膏制備:稱取50g 漢麻葉干粉，沸水提取兩次，每次提取1h，第一次400mL 水，第二次300mL 水，合并浸提液，過濾除渣，收集濾液后減壓濃縮，得漢麻葉浸膏。

急性毒性實驗以健康成年小鼠為實驗對象，將漢麻葉浸膏以蒸餾水配制成0.2g/mL 的溶液。以12g/kg 劑量，最大濃度(0.2g/mL)、最大給藥容積(0.3mL/10 g 體重)進(jìn)行最大給藥量實驗。小鼠給藥前禁食不禁水12h，灌胃給予漢麻葉浸膏，一日2 次給藥，間隔6h，觀察動物異常情況，連續(xù)觀察14d。實驗結(jié)束時，將動物稱重、解剖并觀察其主要臟器有無異常變化。

1.2.2 乙醇溶劑法 精確稱取一定量的漢麻葉干粉，加入一定體積的乙醇溶液，在不同溫度、料液比等條件下浸提，提取液過濾除渣，濾液稀釋定容待測。

在單因素優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度和料液比為影響因素，各取3 個水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交實驗設(shè)計，以漢麻葉總黃酮含量為指標(biāo)，確定其最適提取工藝。因素水平表見表1。

表1 乙醇溶劑法因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment design with ethanol solvent extraction

1.2.3 超聲輔助提取法 精確稱取一定量的漢麻葉干粉，加入一定體積的乙醇溶液，在乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比等條件下，超聲輔助浸提，提取液過濾除渣，濾液稀釋定容待測。

在單因素優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時間為影響因素，各取3 個水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交實驗設(shè)計，以漢麻葉總黃酮含量為指標(biāo)，確定其最適提取工藝。因素水平表見表2。

表2 超聲輔助提取法因素水平表Table 2 Factors and levels for orthogonal experiment design with ultrasonic-assisted extraction

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取蘆丁對照液(0.13mg/mL)0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL于10mL 容量瓶中，分別加入5% 亞硝酸鈉溶液0.30mL，搖勻后靜置6min;再加10% 硝酸鋁溶液0.30mL，搖勻后靜置6min;再加4% 氫氧化鈉溶液4.00mL，用60%乙醇定容，搖勻后靜置12min，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液加入量為0 的樣品作空白參比液，于510nm處測定吸光度A，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 樣品測定精密吸取樣品液0.20mL，置于10mL 容量瓶，按1.2.4 的步驟，測定其吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中總黃酮的含量，并計算每克漢麻葉中總黃酮含量(mg/g)和總黃酮得率(Y)。

漢麻葉中總黃酮得率(Y，%)=提取液中總黃酮質(zhì)量(g)/漢麻葉質(zhì)量(g)×100

2 結(jié)果與討論

2.1 急性毒性實驗

以漢麻葉浸膏對ICR 小鼠進(jìn)行急性毒性實驗，給藥劑量12g/kg，連續(xù)觀察14d，12 只小鼠均健康，生長正常，體重增長明顯(表3)。觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠攝食、飲水、大便、黏膜、皮毛、呼吸等均未發(fā)生異常，且2 組小鼠均無死亡。解剖發(fā)現(xiàn)小鼠的心、肝、脾、肺、腎等各種器官沒有肉眼可見的病變，表明漢麻葉浸膏急性毒性較小，使用較安全。

表3 漢麻葉浸膏對小鼠體重變化的影響(ˉx±SD，n=6)Table 3 The effect of China-hemp leaves extract on the body weight of mice (ˉx±SD，n=6)

2.2 乙醇溶劑法工藝優(yōu)化

以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

影響乙醇溶劑法提取漢麻葉中總黃酮的主要影響因素有:乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間和提取溫度等。在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上(結(jié)果未列出)，設(shè)計L9(34)正交實驗，以確定乙醇溶劑法提取漢麻葉總黃酮的最佳工藝，結(jié)果見表4。

由表4 可以看出，極差分析結(jié)果RA＞RC＞RB＞RD，因此各因素對漢麻葉總黃酮提取得率影響的主次順序依次為:乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)＞提取溫度(C)＞提取時間(B)＞料液比(D)。最優(yōu)提取條件為:A1B3C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1 ∶20(g∶mL)，在60℃溫度下提取40min。驗證實驗表明，在此條件下，提取物的總黃酮含量為28.32mg/g(干基)，提取得率為2.83%。

表4 乙醇溶劑法提取漢麻葉總黃酮正交實驗結(jié)果Table 4 Results of orthogonal experiment for total flavonoids extraction from China-hemp leaves with ethanol solvent extraction

2.3 超聲輔助提取法工藝優(yōu)化

影響超聲輔助提取漢麻葉總黃酮的因素有:超聲波頻率、超聲波強(qiáng)度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲提取時間等。固定超聲波和強(qiáng)度，根據(jù)單因素實驗結(jié)果(結(jié)果未列出)，設(shè)計L9(34)正交實驗，以確定超聲輔助提取漢麻葉總黃酮的最佳工藝，結(jié)果如表5 所示。

由表5 可知，極差分析結(jié)果RA＞RB＞RC，因此，各因素對超聲輔助提取漢麻葉總黃酮提取得率影響的主次順序依次為:乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)＞料液比(B)＞提取時間(C)，最優(yōu)提取條件為:A1B3C1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶40(g∶mL)，提取10min。經(jīng)驗證，在此條件下，所得提取物的總黃酮含量為30.52mg/g(干基)，提取得率為3.05%。

通過對上述兩種方法進(jìn)行比較，超聲輔助提取法最優(yōu)提取時間只有乙醇溶劑法的1/4，所需乙醇體積分?jǐn)?shù)(60%)也比乙醇溶劑法(70%)略低，提取溫度為室溫。提取時間縮短有利于提高生產(chǎn)效率，提取溫度降低有助于降低能耗，更重要的是，低溫快速提取可有效保持漢麻葉中黃酮物質(zhì)的生物活性［11］。利用超聲輔助提取技術(shù)可有效地提高漢麻葉中總黃酮的提取得率，該方法目前已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用［12-13］。漢麻葉總黃酮的提取得率達(dá)到3.05%，表明漢麻葉中總黃酮含量較高，同目前常用的銀杏葉等植物原料相比，漢麻葉來源廣泛，其成本上的特殊優(yōu)勢顯示了良好的開發(fā)前景［14-15］。

表5 超聲輔助提取漢麻葉總黃酮正交實驗結(jié)果Table 5 Results of orthogonal experiment for total flavonoids extraction from China-hemp leaves with ultrasonic-assisted extraction

3 結(jié)論

急性毒性實驗表明，漢麻葉浸膏大劑量給予小鼠未見明顯毒性反應(yīng)。漢麻葉中含有豐富的黃酮類化合物，超聲輔助法能對其進(jìn)行有效提取。最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶40(g∶mL)，提取10min。在此條件下，提取的漢麻葉總黃酮含量為30.52mg/g(干基)，提取得率為3.05%，與文獻(xiàn)報道銀杏葉中提取得率相當(dāng)。超聲輔助法是一種有效的提取過程強(qiáng)化方法，可大大縮短提取時間，降低提取溫度，有助于提高漢麻葉總黃酮提取效率。

由于漢麻來源廣泛，漢麻葉中的黃酮類化合物值得進(jìn)一步開發(fā)利用。本研究可拓展植物黃酮的來源，并為漢麻葉的綜合利用提供了新的技術(shù)支撐。

［1］何錦風(fēng)，杜軍強(qiáng)，陳天鵬.漢麻葉的生物活性成分研究現(xiàn)狀［J］.中國食品學(xué)報，2011，11(8):133-140.

［2］張建春，何錦風(fēng).漢麻籽綜合利用加工技術(shù)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2010:1-2.

［3］杜軍強(qiáng)，何錦風(fēng)，蒲彪，等.漢麻籽營養(yǎng)成分及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(11):522-524.

［4］張華，張建春，張杰.漢麻-一種高值特種生物質(zhì)資源及應(yīng)用［J］.高分子通報，2011(8):1-7.

［5］周徐慧，錢平，盧蓉蓉，等.酶法制備漢麻籽蛋白抗氧化肽［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(5):76-81.

［6］杜軍強(qiáng)，何錦風(fēng)，何聰芬，等.漢麻葉活性成分及其藥理特性的研究概況［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8(31):9-11.

［7］李婷婷，蔡光明，朱若華，等.漢麻果膠中總黃酮提取工藝研究［J］.中南藥學(xué)，2011，9(9):672-675.

［8］Biesaga M.Influence of extraction methods on stability of flavonoids［J］.Journal of Chromatography A，2011，1218(18):2505-2512.

［9］李鳳林，李青旺，馮彩寧，等.天然黃酮類化合物提取方法研究進(jìn)展［J］.中國食品添加劑，2008(5):60-64.

［10］劉峙嶸，俞自由，方裕勛，等.微波萃取銀杏葉黃酮類化合物［J］.東華理工學(xué)院學(xué)報，2005，28(2):151-154.

［11］Huang W，Xue A，Niu H，et al.Optimised ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Folium eucommiae and evaluation of antioxidant activity in multi- test systems in vitro［J］. Food Chemistry，2009，114(3):1147-1154.

［12］Pan G，Yu G，Zhu C，et al.Optimization of ultrasoundassisted extraction (UAE)of flavonoids compounds (FC)from hawthorn seed (HS)［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2012，19(3):486-490.

［13］Zhang H F，Yang X H，Zhao L D，et al.Ultrasonic-assisted extraction of epimedin C from fresh leaves of Epimedium and extraction mechanism［J］.Innovative Food Science ＆ Emerging Technologies，2009，10(1):54-60.

［14］Zhang G，He L，Hu M. Optimized ultrasonic - assisted extraction of flavonoids from Prunella vulgaris L.and evaluation of antioxidant activities in vitro［J］.Innovative Food Science ＆Emerging Technologies，2011，12(1):18-25.

［15］張玉祥，邱蔚芬.銀杏葉超聲波提取工藝研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(5):784-785.