任紅梅，劉左軍 ，袁惠君，水清照，祿亞芬

( 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050)

地球表面存在大量的低溫環(huán)境，有80%常年平均氣溫在5℃及以下，使得冷適應(yīng)微生物的分布極為廣泛［1］。目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)低溫纖維素酶都是由低溫微生物產(chǎn)生的，這些微生物主要分布于兩極區(qū)域(土壤、海水、海泥和探險(xiǎn)隊(duì)遺跡)、冰川、海底盆地、緯度較高的凍土區(qū)或特殊的低溫環(huán)境等。與中溫酶相比，低溫酶在自然條件下具有較高的酶活和催化效率，生產(chǎn)工藝中經(jīng)溫和處理即可使酶活喪失，不會(huì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量，且節(jié)省能量和生產(chǎn)費(fèi)用［2］。纖維素酶產(chǎn)生菌種主要是細(xì)菌、放線菌、絲狀真菌等。對(duì)纖維素物質(zhì)降解和纖維素酶的研究中，真菌占主要地位。但自然界中還存在相當(dāng)數(shù)量的纖維素降解細(xì)菌，它們以自己獨(dú)特的方式消化纖維素［3］。細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶較少，主要是內(nèi)切酶，大多無外切酶的形成［4］。此外，細(xì)菌所產(chǎn)纖維素酶一般存在于細(xì)胞內(nèi)或者吸附于細(xì)胞壁，不易分泌到培養(yǎng)液中，故工業(yè)中很少以細(xì)菌作為生產(chǎn)菌種［5］，而本文篩選到的菌株產(chǎn)胞外酶，不需細(xì)胞破碎等技術(shù)，發(fā)酵液經(jīng)離心、純化等步驟即可得到纖維素酶。鑒于此，本文從甘南瑪曲高寒草甸土壤中分離到一株低溫纖維素降解菌，通過響應(yīng)面法對(duì)其生長(zhǎng)和產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為低溫纖維素酶的推廣和廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌M7 枯草芽孢桿菌，分離自甘南瑪曲高寒草甸土壤，由本實(shí)驗(yàn)室篩選得到并保藏;微晶纖維素 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，柱層析;剛果紅 天津市化學(xué)試劑研究所，指示劑;蛋白胨 上海生工生物;酵母膏 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制造廠，生化試劑;3，5-二硝基水楊酸 上海中秦試劑有限公司，化學(xué)純;羧甲基纖維素鈉 天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，分析純;LB 培養(yǎng)基(g/L) 酵母膏5，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂15 ～20，pH7.2 ～7.4;種子培養(yǎng)基(g/L) 酵母膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH7.2～7.4;液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L) 微晶纖維素10，麩皮10，mandels 營(yíng)養(yǎng)液1000mL，吐溫-80 2mL，初始pH。

高壓蒸汽滅菌鍋 SYQ-DSX-280B，上海申安醫(yī)療器械;高速冷凍離心機(jī) TGL-16，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;紫外可見分管光度計(jì) Cary50，上?？茖W(xué)儀器有限公司;超凈工作臺(tái) B104-N，吳江市凈化設(shè)備總廠;生物數(shù)碼顯微鏡 MOTICDMB，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;振蕩培養(yǎng)箱 BS-2F，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器;pH 計(jì) PHS-3D，上海精密科學(xué)儀器有限公司廠;分析天平 AR5120，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵方法 具體發(fā)酵流程圖見圖1。

圖1 菌株M7 發(fā)酵流程圖Fig.1 Fermentation flow chart of strain M7

1.2.2 酶液制備 發(fā)酵72h 后，取發(fā)酵液于4℃、8000r/min 離心10min，得到上清液，即為粗酶液。

1.2.3 酶活測(cè)定 CMCase 測(cè)定采用DNS 法［6］。酶活力定義為每分鐘水解底物產(chǎn)生1μg 還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位(IU)。

1.2.4 繪制M7 生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線 接種M7 于液體培養(yǎng)基中，從第6h 開始測(cè)定OD(600nm)，每3h 測(cè)定一次，繪制生長(zhǎng)曲線;從第24h 開始測(cè)定CMCase 活力，每12h 取樣測(cè)定一次，繪制產(chǎn)酶曲線。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 以蛋白胨、酵母膏、微晶纖維素添加比例，培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)基初始pH，發(fā)酵溫度為影響因子，經(jīng)液體產(chǎn)酶培養(yǎng)，測(cè)定酶活力。每組處理5 個(gè)重復(fù)。

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用3 因素3 水平響應(yīng)面Box-Behnken 設(shè)計(jì)，優(yōu)化M7 產(chǎn)酶條件，實(shí)驗(yàn)因素及水平編碼如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Experimental factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株M7 鑒定

2.1.1 形態(tài)觀察 見圖2。M7 菌體呈直桿狀，成對(duì)或鏈狀排列，經(jīng)革蘭氏染色，呈陽性。

圖2 菌株M7 顯微觀察Fig.2 Microscopic identification of strain M7

2.1.2 生理生化 根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［7］和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［8］，對(duì)菌株M7 進(jìn)行生理生化測(cè)定，結(jié)果如表2。

表2 菌株M7 生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical property of strain M7

2.1.3 16S rRNA 序列比對(duì)及進(jìn)化樹的構(gòu)建 采用改良CTAB 法提取菌株M7 基因組，將基因組送于上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示M7 基因組含1000bp。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析以及Blast 比對(duì)，與之相似度達(dá)98%～99%的菌株大部分為芽孢桿菌，選取其中的18 條芽孢桿菌16S rRNA 序列，采用Clustalx 進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建進(jìn)化樹。由此得知，菌株M7 與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis strain XS6)進(jìn)化距離最近。結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化特性，初步鑒定M7為枯草芽孢桿菌。

圖3 菌株M7 及基于16S rRNA 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Neighbor-Joining tree showing the phylogenetic relationships based on 16S rRNA gene sequences

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 M7 生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶時(shí)間 由圖4 看出，菌株M7 生長(zhǎng)和產(chǎn)酶速度較快。在84～114h 之間，微生物數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定，總細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高水平，CMCase的積累也達(dá)到高峰，故選擇培養(yǎng)84h 時(shí)收集酶液。

圖4 時(shí)間對(duì)M7 生長(zhǎng)及產(chǎn)CMCase 的影響Fig.4 Effect of time on growth and CMCase of strain M7

2.2.2 蛋白胨、酵母膏及微晶纖維素比例對(duì)M7 產(chǎn)酶的影響 由圖5 看出，酵母膏/微晶纖維素為2.5/2.5，蛋白胨為5g/L 時(shí)，發(fā)酵液中CMCase 含量達(dá)到最大值。

圖5 蛋白胨、酵母膏及微晶纖維素比例對(duì)M7 產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of proportion of peptone，yeast extract and microcrystalline cellulose on producing CMCase

2.2.3 轉(zhuǎn)速對(duì)M7 產(chǎn)酶的影響 由圖6 看出，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到180r/min 時(shí)，CMCase 積累達(dá)到最大。故選取振蕩培養(yǎng)箱的轉(zhuǎn)速為180r/min。

圖6 轉(zhuǎn)速對(duì)M7 產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of rotating speed on producing CMCase

2.2.4 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)M7 產(chǎn)酶的影響 如圖7 所示，在自然pH4.83 條件下，CMCase 合成最多，故選擇自然pH 即可。

2.2.5 發(fā)酵溫度對(duì)M7 產(chǎn)酶的影響 如圖8 所示，在25℃時(shí)，CMCase 產(chǎn)量最多，該菌株屬低溫纖維素酶產(chǎn)生菌的范疇［9］。

2.3 響應(yīng)面Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken中心組合原理，設(shè)計(jì)3 因素3 水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。

圖7 初始pH 對(duì)M7 產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of initial pH on producing CMCase

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)M7 產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on producing CMCase

表3 Box-Behnken 優(yōu)化結(jié)果Table 3 Results of Box-Behnken design

2.3.2 二次回歸擬合及方差分析通過Design Expert7.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，建立了CMCase 隨發(fā)酵溫度(A)、pH(B)、轉(zhuǎn)速(C)而變化的二次多項(xiàng)回歸方程為CMCase =4.16-0.35A-0.092B-0.37C-0.013AB-0.13AC + 0.25BC-0.15A2-0.86B2-0.69C2

該回歸方程方差分析如表4，該模型p 值(p ＜0.0001)達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)p =0.0628 ＞0.05，失擬不顯著?；貧w方程復(fù)相關(guān)系數(shù)和校正系數(shù)分別為R2=0.9757，RAdj=0.9445，變異系數(shù)(CV)=5.07%，說明回歸方程的擬合程度較好，預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性，可用回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)菌株M7 產(chǎn)CMCase 條件進(jìn)行優(yōu)化和理論預(yù)測(cè)。

根據(jù)二次多項(xiàng)模型，利用Design Expert7.0 軟件繪出響應(yīng)面圖，見圖9。經(jīng)過模型優(yōu)化，得到預(yù)測(cè)模型為:發(fā)酵溫度20℃，初始pH4.93，轉(zhuǎn)速174.4r/min，CMCase 達(dá)到最大，為4.39U/mL。在實(shí)驗(yàn)中，分別選取發(fā)酵溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速為:20℃、5.0、175r/min 進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，CMCase 優(yōu)化值達(dá)到4.34U/mL。

表4 二次多項(xiàng)模型方差分析Table 4 Analysis of variance and regression for the quadratic model

圖9 中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面圖Fig.9 Surface plot of central composite design(CCD)

3 結(jié)論

從采自瑪曲高寒草甸土壤中篩選分離出一株低溫纖維素降解菌M7，通過形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rRNA 序列分析，初步鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtili)。

通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化顯示，菌株M7 在以5g/L 蛋白胨、2.5g/L 微晶纖維素和2.5g/L 酵母膏的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好并能穩(wěn)定產(chǎn)酶。在pH4.83 時(shí)產(chǎn)CMCase 最高，在pH4 ～pH8 之間產(chǎn)酶比較穩(wěn)定，pH范圍較廣泛。振蕩培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速為175r/min 時(shí)，菌株M7 所產(chǎn)CMCase 活力最高，條件比較溫和。在10～50℃內(nèi)均能生長(zhǎng)，最適產(chǎn)酶溫度為20℃，屬于低溫細(xì)菌的范疇［2，9］;此外，該菌產(chǎn)酶溫度和酵母菌的發(fā)酵溫度相近，可以采用一步發(fā)酵法，糖化過程和乙醇發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行，具有一定的應(yīng)用前景。

［1］朱非，王珊，周培瑾.低溫酶冷適應(yīng)的分子機(jī)制及其在生物技術(shù)中的應(yīng)用［J］.微生物學(xué)報(bào)，2002，42(5) :640-644 .

［2］董碩，遲乃玉，王鑫，等.低溫纖維素酶的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2011(2) :37-41.

［3］王玢，汪天虹，張剛，等.產(chǎn)低溫纖維素酶海洋嗜冷菌的篩選及研究［J］.海洋科學(xué)，2003，27(5) :42-45.

［4］閻伯旭，曲音波，高培基.真菌和細(xì)菌纖維素酶的差別及內(nèi)、外切葡聚糖酶的底物專一性［J］.生命科學(xué)，1999，11( 增刊) :61-64.

［5］錢文佳，闞光鋒，徐仲，等.產(chǎn)低溫纖維素酶南極細(xì)菌的篩選、生長(zhǎng)特性及酶學(xué)性質(zhì)的初步研究［J］.食品科學(xué)，2010，35(1) :15-18.

［6］王福榮.生物工工程業(yè)分析與檢測(cè)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005:211-212.

［7］R E 布坎南，N E 吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］.第八版.北京:科學(xué)出版社，1984.

［8］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001.

［9］林艷梅，生吉萍，申琳.適冷纖維素降解微生物研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)，2010，20(2) :95-98.

［10］張偉心，馬艷玲，霍玉鵬.混合菌發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)菌體蛋白飼料的研究［J］.飼料研究，2000(6) :5-7.

［11］鄭毅，陳接鋒，吳松剛.黑曲霉β-葡聚糖酶固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2000，27(12) :7-10.

［12］Ping RJ，Sun M，Liu JZ，et al.Optimization of fermentation conditions for marine Bacillus licheniformis MP-2 esterase by response surface methodology［J］.Chinese J Appl Environ Biol，2008，14(4) :548-552.

［13］高潤(rùn)池，王曉燕，孟艷芬，等.耐高溫中性纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選及發(fā)酵條件研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(9) :165-169.

［14］馮曉虎，朱衛(wèi)華，吳弘，等.若爾蓋高原濕地纖維素降解菌組成及產(chǎn)酶特性［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2010，16(3) :399-402.

［15］段學(xué)輝，顏淑芳，彭云召，等.響應(yīng)面法優(yōu)化灰綠青霉Penicillium glaucum NS16 產(chǎn)酶條件［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，29(3) :464-470.

［16］Shen J，Agblevor FA.The operable modeling of simultaneous saccharification and fermentation of ethanol production from cellulose［J］.Appl Biochem Biotechnol，2010，160(3) :665-681.

［17］Rocky - Salimi K，Hamidi - Eshahani Z，Dehghanshoar Z.Evaluation of the effect of particle size，aeration rate and harvest time on the production of cellulose by Trichoderma reesei QM9414 using response surface methodology［J］.Food Bioprod Process，2010，88(1) :61-66.

［18］朱婧，王青艷，劉演景，等.響應(yīng)面法分析優(yōu)化米曲霉β-葡萄糖苷酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(8) :215-218.

［19］Huai LH，Chen N，Bai G，et al.Optimization of Enzyme Production Conditions of Pseudomonas sp.TS1138 by Response Surface Methodology［J］.Food Science，2007，28(12) :336-339.

［20］李師翁，孔凱，馮佳麗，等.產(chǎn)低溫纖維素酶放線菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)初步研究［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2010(7) :216-220.

［21］白東棟，吳堅(jiān)平，徐剛，等.響應(yīng)面法優(yōu)化烯丙醇酮乙酸酯水解酶的產(chǎn)酶條件［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26(1) :71-76.

［22］易浪波，舒瑯，唐云濤，等.常溫土壤中耐冷菌的分離、鑒定及產(chǎn)酶分析［J］.生物技術(shù)通訊，2012，23(1) :60-64.

［23］陳亮，遲乃玉，張慶芳，等.低溫纖維素酶菌株CNY086 發(fā)酵條件優(yōu)化( Ⅱ) ［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2009，36( 10) : 1553-1556.