柴艷偉，張根義

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

淀粉作為人類主要能量來源，其消化性與人體健康密切相關(guān)。淀粉消化性的測定主要分體外和體內(nèi)兩種方法，體外測定方法較多，其中Englyst法[1]采用雙酶水解法，能夠較準(zhǔn)確地模仿淀粉消化的胃腸道內(nèi)環(huán)境，常被用作一種簡單快捷的淀粉消化性的體外測定方法。已有大量研究表明茶多酚（tea polyphenols，TPLs）具有許多生理活性，能影響多種慢性疾病的致病機(jī)制；另外，茶多酚能夠顯著抑制淀粉酶活性[2-5]，如唾液淀粉酶、α-淀粉酶及葡萄糖苷酶等，降低葡萄糖的產(chǎn)生速率。近年來，茶多酚對淀粉的消化性和餐后血糖應(yīng)答反應(yīng)的影響也越來越多的受到關(guān)注。研究表明，茶多酚能通過氫鍵作用和疏水相互作用與酶結(jié)合，從而改變酶的構(gòu)象，影響酶的活力[6]。也已有大量研究表明，茶多酚對α-淀粉酶有強(qiáng)烈的抑制作用，但是有關(guān)茶多酚對淀粉葡萄糖苷酶影響的研究較少。本文主要目的是通過研究茶多酚對豬胰α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶（產(chǎn)自Rhizopus mold）兩種酶的動力學(xué)影響，測定茶多酚的存在是否影響含有茶多酚等酚類物質(zhì)的食品體系中淀粉的體外消化特性，以期為食品工業(yè)中淀粉消化性測定提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普通玉米淀粉（烘干后使用） 市售；茶多酚 杭州和田生物技術(shù)有限公司；豬胰α-淀粉酶（PPA） EC 3.2.1.1，VI-B型，19.6U/mg，Sigma公司；淀粉葡萄糖苷酶EC 3.2.1.3 產(chǎn)自Rhizopus mold，21100U/g，無錫諾維信酶制劑公司；EnzChek?Ultra Amylase Assay Kit E33651 Molecular Probes公司；HK法葡萄糖測定試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司；乙腈、三氟乙酸 色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SpectraMax M5酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；F-7000型熒光光譜儀 日本日立公司；1200高分離度快速液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；恒溫水浴振蕩器，離心機(jī)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶多酚基本組成成分的測定 利用高效液相以四種單體的標(biāo)準(zhǔn)品作對照，對茶多酚樣品的成分進(jìn)行測定。采用紫外檢測器，Hypersil BDS C18柱，柱溫25℃，檢測波長280nm，流動相為乙腈-水（含一定體積分?jǐn)?shù)的三氟乙酸）溶液，梯度洗脫，流動相流速為1.0mL/min。

1.2.2 茶多酚對豬胰α-淀粉酶（PPA）動力學(xué)的影響 采用EnzCheck?α-淀粉酶試劑盒（E33651）測定豬胰α-淀粉酶的酶活。

最大抑制率與IC50的測定：向96 孔板中加入100μL的200μg/mL DQ-淀粉溶液，然后加入100μL的α-淀粉酶與茶多酚的混合液，使最終體系中α-淀粉酶的濃度為5mU/mL（最適酶濃度范圍），茶多酚的濃度分別為0～25μg/mL，在37℃避光保溫30min（最適反應(yīng)時間）后，采用F-7000熒光儀測反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度?？瞻讓φ罩胁患应?淀粉酶，實驗中所用溶劑均為1×緩沖液（MOPS 0.05mol/L，pH 6.9）。抑制率按下式計算：

式中，A為不加茶多酚組扣除相應(yīng)不加酶空白對照的熒光值，B為添加茶多酚組扣除相應(yīng)不加酶空白對照的熒光值。

抑制類型的測定：不同濃度的DQ-淀粉（0～100μg/mL）與5mU/mL α-淀粉酶和16μg/mL茶多酚在37℃避光保溫30min后，測反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，相應(yīng)的空白對照不加α-淀粉酶。以1/[DQ-淀粉]（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以1/[V]為縱坐標(biāo)做Lineweaver-Burk曲線進(jìn)行動力學(xué)分析，判斷茶多酚對α-淀粉酶的抑制類型。

1.2.3 茶多酚對淀粉葡萄糖苷酶動力學(xué)的影響 普通玉米淀粉（normal corn starch，NCS）作底物時需經(jīng)過95℃水浴糊化20min，麥芽糖可直接溶于水中，配成一定濃度的溶液，置于37℃水浴中保溫備用。

茶多酚對淀粉葡萄糖苷酶（amylodlucosidase，AMG）催化活性的影響：將預(yù)熱到37℃的不同濃度茶多酚與淀粉葡萄糖苷酶的混合液加入到已經(jīng)預(yù)熱至37℃的底物中，使得最終體系中的酶濃度為4U/mL。準(zhǔn)確反應(yīng)3min后，用無水乙醇滅活（乙醇最終濃度為90%），經(jīng)3000r/min離心20min后取上清液采用HK-試劑盒測定體系中的葡萄糖濃度。

酶促動力學(xué)常數(shù)測定：在4mg/mL茶多酚存在的情況下（對照組不加茶多酚），不同濃度的底物與4U/mL的酶準(zhǔn)確反應(yīng)3min后，用無水乙醇滅活，經(jīng)3000r/min離心20min后取上清液測定體系中葡萄糖濃度。

不同濃度茶多酚對AMG熒光光譜的影響：用pH4.6的醋酸緩沖液分別配制一定濃度的淀粉葡萄糖苷酶溶液與茶多酚溶液，兩者按不同比例混合，使得最終體系中酶濃度4U/mL，茶多酚濃度分別為0、0.01、0.05、0.1mg/mL，茶多酚與酶在37℃作用3min后，測定其熒光光譜。Ex為282nm，Em為300～400nm，Ex與Em的狹縫都為5nm。

1.2.4 茶多酚對Englyst法淀粉體外消化的影響 茶多酚對Englyst法中混合酶的影響：取2mL預(yù)熱到37℃的25mg/mL淀粉糊化液（95℃水浴中糊化20min）置于試管中，然后加入0.5mL預(yù)先與不同濃度茶多酚已混合均勻的混合酶液（α-淀粉酶3800U/mL，AMG 13U/mL），對照組不添加茶多酚。上述反應(yīng)液在37℃水浴中160r/min振蕩反應(yīng)5min后取100μL的上清液加入900μL無水乙醇滅酶后，經(jīng)3000r/min離心20min，采用HK試劑盒測定上清液的葡萄糖含量。

不同濃度茶多酚對淀粉消化的影響：將500mg的普通玉米淀粉及玻璃珠置于三角瓶中，同時加入20mL醋酸鈉緩沖液（pH=5.2），混合均勻后在95℃水浴中糊化20min，轉(zhuǎn)入37℃水浴，待溫度恒定后加入5mL已預(yù)熱到37℃的混合酶液（α-淀粉酶3800U/mL，淀粉葡萄糖苷酶13U/mL），其中茶多酚組的混合酶液預(yù)先加入不同量的茶多酚并混合均勻，使得最終體系中茶多酚的濃度為淀粉濃度的10%和25%。上述反應(yīng)液在37℃水浴中以160r/min分別振蕩反應(yīng)20、40、60、120min后取100μL的上清液加入900μL無水乙醇滅酶后，經(jīng)3000r/min離心20min，采用HK試劑盒測上清液的葡萄糖含量。

2 結(jié)果與討論

圖1 茶多酚樣品HPLC吸附曲線Fig.1 HPLC profile of tea polyphenols

經(jīng)HPLC檢測分析，實驗中所用茶多酚的四種單體的含量如下：EGC占14.81%、EGCG占48.75%、EC占5.09%、ECG占9.28%，四種單體的含量總和為77.93%，此外還含有咖啡堿等少量其他物質(zhì)。

2.1 茶多酚對α-淀粉酶動力學(xué)的影響

圖2 TPLs對豬胰α-淀粉酶抑制率的測定Fig.2 The inhibition profile of PPA activity by TPLs

所用EnzCheck?α-淀粉酶試劑盒（E33651）中含有一種被BODIPY熒光染色劑標(biāo)記的淀粉衍生物-DQTM-淀粉，熒光染色劑與淀粉連接后其熒光被猝滅。淀粉酶能有效的降解該淀粉衍生物，隨著淀粉被消化，熒光染色劑同時被釋放，反應(yīng)釋放的熒光強(qiáng)度與淀粉酶的酶活力成正比。之所以使用該試劑盒是因為其具有快速高效、靈敏度高、操作方便等優(yōu)點；并且，相比傳統(tǒng)的測定淀粉酶活力的DNS法來說，該試劑盒的測定結(jié)果不受茶多酚等具有還原性的物質(zhì)的影響，測定結(jié)果更準(zhǔn)確。

如圖2所示，茶多酚對α-淀粉酶的催化活性具有明顯的抑制作用。隨著茶多酚的濃度增加，其對α-淀粉酶的抑制效果也明顯增加。在茶多酚的濃度達(dá)到15%（TPLs/DQ-淀粉）時，對α-淀粉酶的催化活性抑制率達(dá)到最大值88%。當(dāng)茶多酚濃度繼續(xù)增加時，其對酶活力的抑制效果不再增加。除此之外，還采用Michaelis-Menten動力學(xué)模型對抑制類型進(jìn)行了研究。圖3采用雙倒數(shù)作圖法，以1/[DQ-淀粉]（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以1/[V]為縱坐標(biāo)做Lineweaver-Burk曲線，結(jié)合米氏方程計算得到：添加茶多酚后α-淀粉酶的Vmax由1666.7min-1降低到1333.3min-1，Km沒有發(fā)生變化，為67.3μg/mL，由此判斷茶多酚對α-淀粉酶的抑制作用屬于非競爭性抑制，與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[3-4，7]。

圖3 TPLs對PPA的抑制動力學(xué)曲線（Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖）Fig.3 The Lineweaver-Burk plot between enzyme reaction rate and substrate concentration of DQ starch for PPA

2.2 茶多酚對淀粉葡萄糖苷酶動力學(xué)及熒光光譜的影響

決定蛋白質(zhì)具有熒光特性的三種最主要的氨基酸分別為色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe），三者的熒光強(qiáng)度比通常為100∶9∶0.5，所以通?？梢哉J(rèn)為蛋白質(zhì)的熒光特性主要由其結(jié)構(gòu)中的色氨酸（Trp）經(jīng)激發(fā)后產(chǎn)生的。通過測定加入茶多酚前后酶蛋白溶液的熒光強(qiáng)度的變化，可以推測出茶多酚與酶蛋白溶液的相互作用的情況以及酶蛋白構(gòu)象的變化[8]。

如圖4所示，以282nm為激發(fā)波長，淀粉葡萄糖苷酶在338nm處具有最大發(fā)射波長。當(dāng)加入茶多酚后，隨著茶多酚濃度的增加，淀粉葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度隨之降低，在茶多酚達(dá)到0.1mg/mL時，淀粉葡萄糖苷酶熒光強(qiáng)度已接近完全猝滅；但茶多酚加入并未改變淀粉葡萄糖苷酶的最大發(fā)射峰的波長。茶多酚對淀粉葡萄糖苷酶的熒光猝滅的結(jié)果表明，茶多酚能與淀粉葡萄糖苷酶產(chǎn)生相互作用，改變淀粉葡萄糖苷酶的構(gòu)象，使暴露在外的色氨酸數(shù)目減少，進(jìn)而使得淀粉葡萄糖苷酶發(fā)生熒光猝滅。

圖4 TPLs對淀粉葡萄糖苷酶的熒光猝滅效應(yīng)的影響Fig.4 Quenching of fluorescence spectra of AMG by TPLs

圖5 TPLs對淀粉葡萄糖苷酶催化活性的影響Fig.5 Effects of TPLs on amyloglucosidase activity in different substrate systems

淀粉體外消化實驗中，α-淀粉酶與淀粉葡萄糖苷酶同時加入到淀粉糊化液中，對其進(jìn)行消化，因此，淀粉葡萄糖苷酶除了水解由α-淀粉酶消化淀粉產(chǎn)生的麥芽糖以消除麥芽糖對PPA的產(chǎn)物抑制作用，同時也對淀粉進(jìn)行水解。如圖5所示，在不同底物存在的體系中，TPLs對淀粉葡萄糖苷酶的催化活性都具有明顯的促進(jìn)作用。隨著TPLs的濃度增加，其對淀粉葡萄糖苷酶的促進(jìn)效果也明顯增加。在TPLs的濃度達(dá)到3mg/mL時對酶活性的促進(jìn)效果的增幅減緩。另外，從圖5中還可以看出，底物濃度不同時，TPLs對淀粉葡萄糖苷酶的催化活性的促進(jìn)程度也存在差別；且這種差別與底物的種類也有關(guān)系。已有研究表明，茶多酚中的羥基和沒食子?；芘c酶中的極性基團(tuán)形成氫鍵，另外，茶多酚中的疏水性沒食子?；芘c酶中疏水性的氨基酸通過疏水相互作用結(jié)合。茶多酚通過氫鍵與疏水相互作用與酶蛋白結(jié)合后，從而顯著的影響酶的催化活性，這種影響與化合物的分子結(jié)構(gòu)和濃度、酶蛋白的氨基酸組成及構(gòu)型等密切相關(guān)[5]。表1中數(shù)據(jù)表明不論是以麥芽糖做底物還是以普通玉米淀粉做底物，添加TPLs后淀粉葡萄糖苷酶的的Vmax都沒有發(fā)生變化，Km減小，即添加茶多酚后，茶多酚與淀粉葡萄糖苷酶結(jié)合，使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，從而增加了酶與底物的親和力。這與圖4中的數(shù)據(jù)得出的結(jié)論相吻合。

表1 淀粉葡萄糖苷酶的動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of amyloglucosidase activation by TPLs

與其他已報道的的研究不同，本文中使用的淀粉葡萄糖苷酶是由Rhizopus mold霉菌產(chǎn)生的，以往的文獻(xiàn)多采用哺乳動物中的葡萄糖苷酶來進(jìn)行研究。大多數(shù)相關(guān)文獻(xiàn)報道茶多酚能有效抑制哺乳動物的葡萄糖苷酶催化活性，如小鼠小腸中的α-葡萄糖苷酶等[4，6]；而從圖5可以看出，TPLs對由Rhizopus mold產(chǎn)生的淀粉葡萄糖苷酶的活性具有明顯的促進(jìn)作用。由此可見，來源不同的酶，相同的物質(zhì)與其相互作用的情況也存在差異[9]。另外，考慮到Rhizopus mold是真菌，真菌通常與與植物共生，而酚類化合物是植物中常見的物質(zhì)，推測可能Rhizopus mold與哺乳動物的生存環(huán)境不同，兩者產(chǎn)生的葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)存在差異，從而使得TPLs對兩種酶的催化活性的影響也截然不同。

2.3 茶多酚對Englyst法淀粉體外消化的影響

圖6 TPLs對Englyst法雙酶催化活性的影響Fig.6 The inhibition profile of TPLs on dual enzyme reaction

Englyst法是測定淀粉體外消化性最常用的一種方法，胰α-淀粉酶與產(chǎn)自真菌的葡萄糖苷酶則是該方法中常用的兩種酶。圖6即為Englyst法中茶多酚對兩種酶影響的情況，其中抑制率表示添加茶多酚后葡萄糖生成量的變化值與淀粉對照組葡萄糖生成量的比值。從圖6中可以看出，在茶多酚濃度較低時，茶多酚對混酶的催化活性存在抑制作用，當(dāng)茶多酚濃度達(dá)到12.5%（TPLs/NCS）時，抑制效果最佳，抑制率達(dá)30%；當(dāng)茶多酚濃度超過20%（TPLs/NCS）時，茶多酚對淀粉的消化反而起到促進(jìn)作用，最大促進(jìn)率為20%。由此可見，不同濃度茶多酚對Englyst中混酶體系的影響不同，并非單純的抑制或者促進(jìn)，與茶多酚的濃度密切相關(guān)。如圖7所示，分別選取茶多酚的兩個代表濃度：10%（TPLs/NCS）與25%（TPLs/NCS），測定了茶多酚對Englyst法淀粉體外消化性的影響。與對照組比較，添加10% TPLs組生成葡萄糖的濃度較低，淀粉的消化受到抑制；添加25%TPLs組生成葡萄糖的濃度相對較高，促進(jìn)了淀粉的消化。這是因為不同濃度的茶多酚對混酶產(chǎn)生的作用不同，從而對淀粉消化的影響也不同。由此可見，茶多酚等酚類物質(zhì)存在時，對淀粉酶的催化活性存在影響[10-11]，進(jìn)而對Englyst法測定淀粉的消化性結(jié)果存在一定的影響，所以在使用體外方法測定酚類物質(zhì)存在的淀粉食品的消化性時，應(yīng)當(dāng)對酚類物質(zhì)對淀粉酶的影響予以考慮，以保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖7 不同濃度TPLs對Englyst法淀粉酶解曲線的影響Fig.7 The starch digestion profile by dual enzymatic Englyst methods affected by TPLs with different concentrations

3 結(jié)論

3.1 15%（TPLs/DQ-淀粉）的TPLs對α-淀粉酶的抑制效果最佳，抑制率達(dá)88%，抑制類型屬于非競爭性抑制。

3.2 TPLs可使淀粉葡萄糖苷酶發(fā)生熒光猝滅，對淀粉葡萄糖苷酶具有明顯的促進(jìn)作用，添加茶多酚后淀粉葡萄糖苷酶的Vmax不變，Km減小。

3.3 12.5%（TPLs/NCS）TPLs對Englyst法混酶體系的抑制效果最佳，抑制率達(dá)30%；TPLs濃度超過20%（TPLs/NCS）時，TPLs對混酶反而起促進(jìn)作用，最大促進(jìn)率為20%。

3.4 與對照組比較，添加10%TPLs組淀粉的消化受到抑制；添加25% TPLs組淀粉消化則被促進(jìn)。

[1] Englyst H N，Kingman S M，Cummings J H. Classification and measurement of nutritionally important starch fractions[J]. Eur J Clin Nutr，1992，46（2）：S33-S50.

[2] 王文君，姚江武，陶濤.紅茶和綠茶多酚對豬胰腺α-淀粉酶抑制效果的動力學(xué)研究[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究，2008，25（4）：442-446.

[3] HaraYukihiko，Honda Miwa. The inhibition of a-amylase by tea polyphenols[J]. Agric Biol Chem，1990，54：1939-1945.

[4] Young-in Kwon，Emmanouil Apostolids，Kalidas Shetty.Inhibitory potential of wine and tea against α-amylase and aglucosidase for management of hyperglycemia linked to type 2 diabetes[J]. Journal of Food Biochemistry，2008，32：15-31.

[5] Qiang He，Yuanping Lv，Kai Yao. Effects of tea polyphenols on the activities of a-amylase，pepsin，trypsin and lipase[J].Journal of Food Chemistry，2006，101：1178-1182.

[6] Koh L W，Wong L L，Loo Y Y. Evaluation of different teas against starch digestibility by mammalian glycosidases[J]. J Agric Food Chem，2010，58（1）：148-154.

[7] Grussu D，D Stewart，G J McDougall，Berry Polyphenols.Inhibit α-Amylase in Vitro：Identifying Active Components in Rowanberry and Raspberry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（6）：2324-2331.

[8] 陳國珍，黃賢智，許金鉤，等. 熒光分析法[M]. 第2版. 北京：科學(xué)出版社，1990：123.

[9] Oki T，Matsui T，Osajima Y. Inhibitory effect of alphaglucosidase inhibitors varies according to its origin[J]. J Agric Food Chem，1999，47（2）：550-553.

[10] Wang H，Du Y-J，Song H-C. α-Glucosidase and α-amylase inhibitory activities of guava leaves[J].Journal of Food Chemistry，2010，123（1）：6-13.

[11] Bhandari M R，Jong-Anurakkun N，Hong G. α-Glucosidase and α-amylase inhibitory activities of Nepalese medicinal herb Pakhanbhed（Bergenia ciliata，Haw.）[J].Journal of Food Chemistry，2008，106（1）：247-252.