張 偉 李福榮

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000)

芹菜籽含有豐富的營(yíng)養(yǎng)元素以及多種具生理活性的物質(zhì)，主要包括揮發(fā)油化合物、不飽和脂肪酸、類黃酮物質(zhì)、丁基苯酞類、氨基酸、膳食纖維、香豆素衍生物等多種物質(zhì)。芹菜籽具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂等多種藥理活性，它的提取物對(duì)已孕或未孕子宮具有收縮作用，可以治療痛經(jīng)［1］，在澳洲，芹菜籽油還被用于治療關(guān)節(jié)疼痛。芹菜籽作為一種具有良好發(fā)展前景的抗腫瘤藥物，已受到研究者的廣泛關(guān)注，但對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響及分子機(jī)制尚未見報(bào)道。本課題就芹菜籽提取物對(duì)卵巢癌細(xì)胞的凋亡作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，旨在為芹菜素應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌細(xì)胞SKOV-3購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板(costar公司)，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibic公司)，10%新生牛血清(杭州四季青公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)promega公司)，硝酸纖維素膜(英國(guó)Buckinghamshire，Amersham公司)

1.2 方法

1.2.1 CO2超臨界萃取法(SFE--CO2)提取芹菜籽粗提物取經(jīng)烘干、粉碎、過篩(60目)的芹菜籽350 g，SFE流程:CO2鋼瓶→冷凍系統(tǒng)→高壓泵→萃取釜→解析釜Ⅰ→解析釜Ⅱ→冷凍系統(tǒng)(循環(huán))。萃取物為半固體油狀物，顏色為深褐色，得到量為98 g。

1.2.2 對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)消除率的測(cè)定用70%乙醇配制濃度分別為不同濃度的芹菜籽提取液混合物溶液2.5 ml。配制0.2 mmol/L的DPPH溶液。取500 μL樣液加入2 ml 0.2mmol/L的DPPH溶液和1.5 ml 70%乙醇，搖勻后水浴30 min，以70%乙醇溶液作對(duì)照，分別測(cè)定517 nm處的吸光值A(chǔ)。同時(shí)測(cè)定樣本溶液500 μL與3.5mL70%乙醇溶液混合后517nm處的吸光值A(chǔ)0，再測(cè)定2 ml DPPH溶液與2 ml 70%乙醇混合液在517nm處的吸光值A(chǔ)1，所有測(cè)定平行進(jìn)行三次，取平均值。

按下式計(jì)算其清除率［2］:

清除率(%)=［1-(A-A0)/A1］×100

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將卵巢癌SKOV-3細(xì)胞置于含有10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、體積分?jǐn)?shù)0.05%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80～90% 時(shí)，以0.25%胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)各組藥物對(duì)凋亡的影響 制備細(xì)胞爬片，終濃度為0.05、0.5、5 μg/L的芹菜籽提取物作用12h。室溫下4%多聚甲醛固定20 min。每片蓋玻片加Annexin-V FITC和碘化丙啶(PI)染色封片，立即在488 nm波長(zhǎng)下用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Caspase-3蛋白的表達(dá)

設(shè)空白對(duì)照組及 0.05，0.5，5 μg·/L CSE 處理組。收獲處理12 h后的各組細(xì)胞，用RIPA液裂解提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取40 μg總蛋白選擇12%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，完畢后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂奶粉的TBST封閉4 h后分別加1∶500稀釋的兔抗人Caspase-3多克隆抗體，4℃ 孵育過夜，TBST洗滌3次，再加1∶1000稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG溫育2 h，TBST洗3次，進(jìn)行顯影。用Image-Pro Plus-Version 6.0 for windowsTM圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的灰度值，以表示Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 DPPH消除率的測(cè)定

DPPH是一種非常穩(wěn)定、可以長(zhǎng)時(shí)間保存的自由基，經(jīng)常被用來作為測(cè)試抗氧化性試劑。當(dāng)它遇到能釋放質(zhì)子的物質(zhì)或者被還原時(shí)，自由基被消除，化合物溶液顏色發(fā)生顯著變化，溶液從紫色脫至淡黃色。加入樣品后，在517nm處測(cè)定其吸光度的變化，可求得樣品對(duì)DPPH的消除率。結(jié)果表示芹菜籽提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，并且在一定范圍內(nèi)具有一定的濃度依賴性。見表1。

表1 芹菜籽提取物對(duì)DPPH的清除率

圖1 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)CSE對(duì)SKOV-3細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變

2.2 CSE對(duì)SKOV-3細(xì)胞凋亡的作用

經(jīng)0.05、0.5、5 μg/L CSE 處理12 h 后，激光共聚焦顯微鏡觀察到，在損傷組早期以及晚期凋亡細(xì)胞數(shù)均較多，早期凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞膜著綠色，晚期則表現(xiàn)為細(xì)胞核著色，或者紅色細(xì)胞核濃染固縮并將游移出細(xì)胞，即典型的凋亡小體表現(xiàn)。另有較多的細(xì)胞主要呈現(xiàn)紅色的細(xì)胞核，細(xì)胞膜破碎甚至而不見細(xì)胞膜，呈現(xiàn)晚期凋亡典型的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。見圖1。

2.3 CSE對(duì)SKOV-3細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)0.05、0.5、5?g/L CSE 作用12h后，采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)，可見各組細(xì)胞中內(nèi)參蛋白β-actin條帶亮度相似，在32 kD位置均出現(xiàn)Caspase-3特異性蛋白條帶，但經(jīng)過CSE處理后，Caspase-3蛋白條帶表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。見圖2。

圖2 CSE對(duì)SKOV-3細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

自由基在生物體衰老與疾病以及正常的免疫、代謝與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等過程中都起著重要的生理作用，有機(jī)體的許多病理生理現(xiàn)象如衰老、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷都與自由基對(duì)機(jī)體的氧化損傷有關(guān)，因此尋找能夠清除自由基的抗氧化劑就顯得十分重要，此外清除自由基作用可能也是芹菜籽具有抗腫瘤活性和提高肌體免疫能力的一個(gè)因素。

中草藥中含有豐富的自由基清除成分，研究表明芹菜籽提取物還具有一定的抗氧化性，芹菜所含豐富的黃酮類化學(xué)物具有抗氧化清除自由基的能力。Momin RA［3］從芹菜籽中得到的兩種化合物在濃度分別為125g/L、250g/L時(shí)顯示出很好的抗氧化性。其中黃酮中含有的3-正丁基苯酞和芹菜鎮(zhèn)靜素(Sedanolide)具有抗腫瘤的活性，可使腫瘤發(fā)生率從68%各下降至30%和11%。南京趙珺的研究表明芹菜素在25～100μg/mL范圍內(nèi)能有效清除DPPH自由基和羥自由基(HO·)，減輕HO·對(duì)DNA 的損傷［4］。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液吸光度，利用DPPH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)芹菜籽提取物各成分抗氧化作用的能力，結(jié)果證實(shí)芹菜籽的提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，并且與濃度呈現(xiàn)一定依賴性。

應(yīng)用Annexin-V聯(lián)合PI雙染色法對(duì)卵巢癌細(xì)胞染色，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，Annexin-V可以細(xì)胞膜的磷脂酰絲氨酸發(fā)生特異性結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，磷脂酰絲氨酸外露，Annexin-V可以與其結(jié)合，細(xì)胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，所以可以用來檢測(cè)凋亡早期細(xì)胞;PI可以在凋亡后期進(jìn)入凋亡小體，與DNA結(jié)合，細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光，所以可以用來檢測(cè)晚期凋亡細(xì)胞。該染色可以區(qū)分早期和晚期凋亡的細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的CSE對(duì)SKOV-3細(xì)胞作用12h就可以顯著增加細(xì)胞的凋亡，且隨著濃度的增加，CSE對(duì)SKOV-3細(xì)胞的促凋亡作用逐漸增強(qiáng)，呈一定的劑量依賴性。

目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞凋亡受抑是腫瘤發(fā)生的重要原因，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為現(xiàn)代抗腫瘤治療的新策略。細(xì)胞凋亡受機(jī)體促凋亡調(diào)節(jié)分子如Caspase家族和抑制凋亡調(diào)節(jié)分子如凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosisproteins，IAP)等家族的調(diào)節(jié)，是一種細(xì)胞程序性的死亡過程，是機(jī)體清除衰老、損傷和突變細(xì)胞的重要方式。目前在人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)Caspase家族中起核心作用的是Caspase-3［5］。同時(shí)Caspase-3活性增加是細(xì)胞凋亡的一種重要機(jī)制。因?yàn)檎Ｇ闆r下細(xì)胞質(zhì)中的Caspase-3以無活性的procaspase-3形式存在，在多種凋亡信號(hào)刺激下經(jīng)蛋白水解作用將無活性的前體procaspase-3激活成活化的Caspase-3，從而引起細(xì)胞凋亡。

實(shí)驗(yàn)中我們采用 Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)0.05、0.5、5 μg/L CSE 作用 12h 后，檢測(cè)到各組細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)，處理后的 SKOV-3細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，隨著濃度增加，Caspase-3條帶亮度增加。因此我們推測(cè)芹菜籽可能通過增加Caspase-3的活性，從而誘導(dǎo)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的凋亡。

［1］ 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中醫(yī)大辭典:上［M］.上海:上?？萍汲霭嫔?，1986.

［2］ 王威.黃酮類食用天然色素抗氧活性的研究［J］.食品科學(xué)，2001，22(5):262-281.

［3］ Momin R A，Nair M G.Antioxidant，cyclooxygenase and topoisomerase inhibitory compounds from Apium graveolens Linn seeds［J］.Phytomedicine，2002，9(4):312-318.

［4］ 趙珺，王麗，李磊，等.芹菜素對(duì)自由基致DNA損傷的保護(hù)作用及機(jī)制［J］.食品科學(xué)，2011，32(13).113.

［5］ Fan T J，Han L H，Cong R S，et al.Caspase family proteases and apoptosis［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2005，37(11):719-27.