高 璐， 唐 偉， 楊振泉， 杭 莉， 高 崧， 方維明

(1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127;2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009;3.泰州市出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 泰州 225300;4.泰州市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 泰州 225300)

弧菌廣泛存在于水產(chǎn)品中，現(xiàn)報(bào)道的共有200多種。其中，有12種對(duì)人體具有很強(qiáng)的致病性，可引起人體嚴(yán)重腹瀉或者傷口感染、中耳炎及敗血癥等［1］。近年來，有關(guān)此類的食物中毒事件的案例不斷增加，因而對(duì)消費(fèi)者的健康構(gòu)成潛在的威脅［2］。副溶血弧菌和溶藻弧菌是2種重要的致病菌種，通常認(rèn)為他們是條件致病菌，是引起海洋魚類和無脊椎動(dòng)物大量死亡的主要原因，并且每年導(dǎo)致全世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大量的經(jīng)濟(jì)損失［3-6］。

微生物分型技術(shù)是進(jìn)行食品中微生物檢測(cè)和流行病學(xué)研究中必不可少的工具，但研究結(jié)果表明傳統(tǒng)的血清分型、表型分型技術(shù)在環(huán)境和流行病學(xué)調(diào)查分析中具有局限性。分子分型方法以其高靈敏性、高分型率等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于弧菌的分型和診斷中。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(Random amplified polymorphic DNA，RPAD)是以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，是Williams等［7］和 John 等［8］建立的一種新的揭示基因組多態(tài)性的方法，所需要的引物無需專門設(shè)計(jì)，模板DNA用量少，靈敏度高，已被廣泛地應(yīng)用于生物的遺傳多樣性和種群的遺傳、分類及親緣關(guān)系等研究。

本研究對(duì)從江蘇省部分地區(qū)淡水產(chǎn)品中分離到的59株副溶血弧菌和107株溶藻弧菌的全基因組進(jìn)行了RAPD分析，旨在探討其種內(nèi)各分離株間的親緣關(guān)系和分子特性，為監(jiān)測(cè)流行株、及時(shí)準(zhǔn)確確立污染源、調(diào)查傳播途徑的研究提供依據(jù)，也為有效預(yù)防控制弧菌引起的腹瀉及食物中毒事件提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 所用菌株均分離自江蘇省連云港、揚(yáng)州、泰州、常州地區(qū)的魚、蝦、蟹、貝等淡水產(chǎn)品，由揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 TCBS瓊脂購于杭州微生物試劑有限公司;PCR所用生物試劑(10×Buffer、RNase、Taq 酶、dNTPs、DNA Marker)均為上海生工生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

SPX-250-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(購自上海博訊公司)，PTC-100 PCR儀(購自美國MJ公司)，DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(購自北京市六一儀器廠)，TG16-WS型高速離心機(jī)(購自湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，GELDOCXR凝膠成像系統(tǒng)(購自BIO-RAD公司)。

1.2 弧菌基因組DNA提取

參照文獻(xiàn)［9］和《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的CTAB法提取弧菌分離株基因組DNA。

1.3 RAPD 擴(kuò)增體系

參照文獻(xiàn)［9］，選取2條隨機(jī)引物(AP11:5'-GGGAACGTGT-3';AP21:5'-AATCGGGCTG-3')進(jìn)行隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增試驗(yàn)。

RAPD擴(kuò)增反應(yīng)體系:模板(100 ng/μl)1.0 μl、dNTPs(10 mmol/L)0.5 μl、隨 機(jī) 引 物 (10 pmol/μL)2.0 μl、10 × Buffer 2.5 μl、MgCl2(25 mmol/L)2.0 μl、Taq 酶 (5 U/μl)0.3 μl、ddH2O 15.7 μl，總體積 25.0 μl。

RAPD熱循環(huán)參數(shù):94℃ 3 min，36℃ 1 min，72℃ 2 min，1次循環(huán);94℃ 1 min，36℃ 55 s，72℃ 2 min，35次循環(huán);94 ℃ 1 min，36 ℃ 55 s，72 ℃ 10 min，1 次循環(huán)。

擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè):取10.0 μl產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(電壓5 V/cm)1.5 h，電泳結(jié)束后經(jīng)溴化乙錠染色20 min，在凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行觀察并拍照。根據(jù)條帶清晰程度，彌散背景情況以及帶型強(qiáng)弱選擇圖片進(jìn)行分析。

1.4 RAPD重復(fù)性試驗(yàn)

取不同的分離株，每個(gè)菌株利用上述建立和優(yōu)化的系統(tǒng)分別獨(dú)立進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增3次，并分析擴(kuò)增譜帶的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.5 RAPD指紋圖譜分析

電泳圖中相同遷移位置上有條帶的記1、無條帶的記0，以1、0數(shù)列矩陣形式記錄PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增位點(diǎn)。利用Popgene 32軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出Nei's基因多樣度、Shannon's信息指數(shù)、遺傳相似度、遺傳距離等數(shù)據(jù)，并根椐遺傳距離利用Mega 4構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 RAPD擴(kuò)增重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)于各分離株進(jìn)行3次RAPD擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖1所示，3次擴(kuò)增獲得的指紋基本一致，顯示指紋圖譜具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

圖1 RAPD指紋圖譜分型Fig.1 The repeated amplification of the isolates by RAPD

2.2 副溶血弧菌RAPD分型

應(yīng)用RAPD分型方法對(duì)59株副溶血弧菌分離株進(jìn)行分析，2種不同隨機(jī)引物AP11、AP21的擴(kuò)增譜帶模式如圖2所示。AP11擴(kuò)增得到8個(gè)不同的指紋圖譜(圖2A)，其中，菌株分布最集中的是1型、4型和 7型，所占的比例分別為32.8%(19/59)、25.4%(15/59)和 22.0%(13/59);AP21擴(kuò)增得到7個(gè)不同的指紋圖譜(圖2B)，其中，菌株分布最集中的是a型、c型和d型，所占的比例分別為39.0%(23/59)、27.1%(16/59)和15.3%(9/59)(表 1)。

圖2 副溶血弧菌RAPD譜帶Fig.2 RAPD patterns of V.parahaemolyticus isolates

按照每個(gè)菌株的2種譜帶模式組合進(jìn)行基因分型，共獲得了18個(gè)基因型別(表1)，其中1a、4a、7d為主要型別，所占比例分別為 16.9%、15.3%、10.2%。根據(jù)分子指紋圖譜計(jì)算Nei氏相似系數(shù)，通過UPGMA聚類分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)進(jìn)一步表明，18個(gè)分子型在相似性80%的基礎(chǔ)上可分為A至I 9個(gè)遺傳譜系，其中A型和C型是副溶血弧菌的主要型別，屬于A型的有17株分離株、C型的有19株，分別占總分離株的28.8%和32.2%，且A型和C型副溶血弧菌在所有采樣地區(qū)和樣品種類中均有檢出(表2)。

圖3 副溶血弧菌分離株的RAPD指紋圖譜聚類分析圖Fig.3 The clustering analysis of RAPD patterns of V.parahaemolyticus isolates

表2 副溶血弧菌在不同地區(qū)、樣品中的分布Table 2 Distribution of different genotypes of V.parahaemolyticus isolates in four samples from all four areas

2.3 溶藻弧菌RAPD分型

應(yīng)用隨機(jī)引物AP11、AP21對(duì)107株溶藻弧菌分離株進(jìn)行隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增分析，不同隨機(jī)引物的譜帶擴(kuò)增模式如圖4所示。AP11擴(kuò)增得到11個(gè)不同的指紋圖譜(圖4A)，其中，菌株分布最集中的是1型、8型和10型，所占比例分別為29.0%(31/107)，15.0%(16/107)和32.7%(35/107);AP21擴(kuò)增得到6個(gè)不同的指紋圖譜(圖4B)，其中，菌株分布最集中的是a型、c型和f型，所占比例分別為50.5%(54/107)，19.6%(21/107)和16.8%(18/107)(表3)。

圖4 溶藻弧菌RAPD譜帶Fig.4 RAPD patterns of V.alginolyticus isolates

按照每個(gè)菌株的2種譜帶模式組合進(jìn)行基因分型，共獲得了21個(gè)基因型別(表3)，其中1a、8c、10a和10f為主要型別，所占比例分別為22.4%、13.1%、19.6和11.2%。根據(jù)分子指紋圖譜計(jì)算Nei氏相似系數(shù)，通過UPGMA聚類分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)進(jìn)一步表明，21個(gè)分子型在相似性80%的基礎(chǔ)上可分為A至I 12個(gè)遺傳譜系，其中A型是溶藻弧菌的最主要型別，含分離株50株，占總分離株的46.7%。溶藻弧菌的譜系A(chǔ)和K在所有采樣地區(qū)和樣品中均有檢出(表4)。

表4 溶藻弧菌在不同地區(qū)、樣品中的分布Table 4 Distribution of different genotypes of V.alginolyticus in four samples from all four areas

圖5 溶藻弧菌分離株的RAPD指紋圖譜聚類分析圖Fig.5 The clustering analysis of RAPD patterns of V.alginolyticus isolates

表3 不同來源的溶藻弧菌分離株的RAPD分型結(jié)果Table 3 Results of RAPD genotyping differently-originated V.alginolyticus isolates

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在基因型方面的分子分型技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。目前，弧菌中應(yīng)用最多的是以脈沖凝膠電泳分析(PFGE)為首的分子分型方法，但是其分型成本高、操作費(fèi)時(shí)而且技術(shù)復(fù)雜，不適用于大量樣品的快速分型［10］。

RAPD技術(shù)具有個(gè)體、種群、亞種和種等各層次水平上的特異性，且操作簡單，所需要引物不需要專門設(shè)計(jì)，適用于大量樣品的快速分型，尤其是在疾病暴發(fā)流行時(shí)，它是分析相關(guān)菌株和排除不相關(guān)菌株的良好基礎(chǔ)，已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、分類及親緣關(guān)系等領(lǐng)域的研究［11］。

本研究在我們已建立的副溶血弧菌RAPD分型技術(shù)的基礎(chǔ)上，選取了AP11、AP21 2條隨機(jī)引物，對(duì)不同來源的副溶血弧菌和溶藻弧菌進(jìn)行分型，結(jié)果顯示，AP11、AP21 2條引物將59株副溶血弧菌分為18個(gè)譜型，將107株溶藻弧菌分為21個(gè)譜型，顯示了副溶血弧菌和溶藻弧菌均具有較好的基因多樣性，這與Sudheesh等［12］的研究基本一致。

從弧菌的地理分布上看，連云港地區(qū)樣品中分離到的副溶血弧菌和溶藻弧菌具有豐富的多態(tài)性，其譜帶模式均多于揚(yáng)州、泰州、常州地區(qū)樣品中分離株。這可能與連云港所處的沿海地理位置相關(guān)，易與海產(chǎn)品發(fā)生相互交叉污染，或是沿海入口的生存環(huán)境(如鹽度、溫度等)更易于弧菌的生長，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)連云港地區(qū)樣品中弧菌的多樣性比揚(yáng)州、泰州、常州地區(qū)豐富［13］。

從弧菌的樣品來源上看，在魚、蟹和蝦這3類樣品中，副溶血弧菌和溶藻弧菌均顯示了較好的多態(tài)性，魚和蝦樣品中分離株的指紋譜帶模式較為接近，而在貝類樣品中的指紋圖譜譜帶比較單一，這可能與這些水生動(dòng)物的生活習(xí)性有關(guān)，也可能與我們樣品數(shù)量有限所致。因而，我們?nèi)孕柽M(jìn)一步的研究以了解他們之間的相關(guān)性。對(duì)這些不同地區(qū)不同樣品的主要攜帶型別進(jìn)行深入的研究，將為水產(chǎn)品中污染源的溯源及水產(chǎn)養(yǎng)殖中疾病傳染的控制提供重要的依據(jù)。

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