喬 娜， 徐旭俊， 劉思國， 王學(xué)斌， 陳建泉， 成國祥

(1.上海杰隆生物工程股份有限公司，上海 201210;2.上海轉(zhuǎn)基因研究中心，上海 201210)

溶菌酶(Lysozyme)是廣泛分布于人和動物機體組織和體液中的一種重要非特異性免疫因子，其在食品醫(yī)藥行業(yè)具有重要意義［1-4］。人溶菌酶(Human lysozyme，hLYZ)具有廣譜抗菌作用，對引發(fā)乳腺炎的金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等具有明顯抑制作用［5］。但人溶菌酶制備材料相當(dāng)有限，通常是從人奶、胎盤或尿液中少量提取，來源極其困難，無法進行工業(yè)化生產(chǎn)［6-8］。利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，使轉(zhuǎn)基因動物分泌的乳汁中含有較強抑菌作用的人溶菌酶成為近幾年的研究熱點。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟，轉(zhuǎn)人溶菌酶基因小鼠、豬、山羊、牛等轉(zhuǎn)基因動物已經(jīng)先后獲得［9-13］。同時，牛、羊等哺乳動物產(chǎn)奶量高，且在動物乳汁蛋白質(zhì)合成過程中可以使伴隨表達的外源蛋白質(zhì)進行真核生物所特有的修飾和加工，使外源蛋白質(zhì)具有較高的生物活性，易于外源蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)。因此，牛、羊成為制備乳腺生物反應(yīng)器的理想動物類型。

但有研究表明，轉(zhuǎn)基因山羊、小鼠乳汁內(nèi)高效表達異源蛋白質(zhì)后可對受體動物正常乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成有一定影響，使泌乳性能下降。通過育種手段改善轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)性能，成為轉(zhuǎn)基因動物育種新的目標(biāo)。本研究對轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊擴群中的繁殖、外源基因遺傳、表達穩(wěn)定性等進行分析，為轉(zhuǎn)基因山羊安全評價、轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊的繁育與檢測方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及來源

轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊G0代為上海轉(zhuǎn)基因研究中心利用體細(xì)胞克隆方法自主研發(fā)獲得的原代健康轉(zhuǎn)hLYZ基因母羊，非轉(zhuǎn)基因普通奶山羊選購自江蘇省徐州睢寧縣。以6只原代轉(zhuǎn)hLYZ基因母羊為基礎(chǔ)，與普通奶山羊公羊自然交配，且從轉(zhuǎn)基因后代羊中挑選優(yōu)秀公、母羊，進行兄妹交配或回交，逐漸組成 F1、F2和 F3代。

1.2 繁殖方式及數(shù)量

對各世代的子代數(shù)量、轉(zhuǎn)基因整合羔羊數(shù)、外源基因整合率等相關(guān)信息進行記錄統(tǒng)計。G0代hLYZ母羊與正常健康非轉(zhuǎn)基因奶山羊公羊自然交配，所生后代中整合檢測呈陽性個體，為F1代轉(zhuǎn)hLYZ基因羊。F1代hLYZ公羊與正常健康非轉(zhuǎn)基因奶山羊、G0代、F1代等轉(zhuǎn)hLYZ基因母羊自然交配，所生后代中整合檢測呈陽性個體，均定義為F2代轉(zhuǎn)hLYZ基因羊。F2代公羊與正常健康非轉(zhuǎn)基因奶山羊、G0代、F2代轉(zhuǎn)hLYZ基因母羊自然交配，所生后代中整合陽性個體，為F3代轉(zhuǎn)hLYZ基因羊。各世代繁殖方式與數(shù)量詳見表1。

1.3 人溶菌酶的PCR整合檢測

分別取 F1、F2和 F3代待測羊血液 200 μl，使用北京天根公司的血液 DNA提取試劑盒(貨號:DP318-02)提取DNA，使用TaKaRa公司的LaTaq酶進行PCR擴增檢測。引物為上游引物:5'-CCTCATAATTCCCTGAGTAAG-3'，下 游 引 物:5'-TGACACTGAGGATTCCACATG-3'，擴增目的片段大小約為850 bp。

PCR擴增體系為:94℃ 5 min;94℃ 40 s，59℃40 s，72 ℃ 50 s，30 個循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。擴增產(chǎn)物取 5 μl上樣，1%Agrose 120 V，電泳 20 min后，拍照鑒定。PCR結(jié)果呈陽性的個體，為整合轉(zhuǎn)基因羊。

1.4 轉(zhuǎn)基因母羊乳汁中hLYZ的Western-blot檢測

收集G0、F1和F2代hLYZ羊乳汁樣品，用無菌雙蒸水進行恰當(dāng)稀釋，加入等體積的SDS上樣緩沖液，煮沸變性5 min，離心，取2 μl上清液進行SDSPAGE電泳，凝膠濃度為12%;蛋白質(zhì)雜交一抗選用兔抗人溶菌酶(DAKO，A0099)，1∶3 000稀釋使用;二抗選用辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(Beyotime，A0208)，1∶3 000稀釋使用。雜交、洗膜等步驟參照常規(guī)Western-blot方法進行。

1.5 轉(zhuǎn)基因母羊乳汁中hLYZ的ELISA檢測

G0、F1和 F2代 hLYZ 羊乳汁樣品 100 μl，選用AssayMax Human Lysozyme ELISA Kit(AssayPro，EL3020-1)進行精確定量，檢測詳細(xì)步驟參照試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊的繁殖

根據(jù)不同交配類型，對各世代轉(zhuǎn)基因山羊的子代數(shù)量、轉(zhuǎn)基因整合情況進行統(tǒng)計。經(jīng)過3個繁殖周期，共獲得 F1代9只，轉(zhuǎn)基因整合率28.13%(9/32);F2代 140只，轉(zhuǎn)基因整合率 45.31%(140/309);F3代 22只，轉(zhuǎn)基因整合率 40.00%(22/55)(表1)。

表1 各世代羊數(shù)量及整合情況Table 1 Numbers of goats and transgenic goats in each generation

2.2 各世代轉(zhuǎn)基因山羊的PCR整合檢測與遺傳穩(wěn)定性分析

部分人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊PCR整合檢測結(jié)果如圖1所示，圖中1～10為待檢測羊只PCR擴增產(chǎn)物，陰性對照選用普通奶山羊基因組擴增產(chǎn)物。整合個體在850 bp處有清晰、特異性擴增產(chǎn)物。該檢測結(jié)果證實，人溶菌酶基因能夠在轉(zhuǎn)基因羊世代間穩(wěn)定遺傳。

圖1 轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊PCR整合檢測圖Fig.1 PCR result for hLYZ transgenetic goats

2.3 hLYZ基因的表達穩(wěn)定性

為明確人溶菌酶在各世代轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中的表達情況，分別應(yīng)用 Western-blot和 ELISA法對不同世代轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中hLYZ基因的表達進行檢測。

2.3.1 Western-blot檢測 對 G0、F1和 F23 個世代轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊乳汁樣品進行Western-blot檢測，結(jié)果(圖2)顯示，各世代轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中均能檢測出與rhLYZ標(biāo)準(zhǔn)品(陽性對照)大小一致的特異性條帶，正常奶山羊乳汁樣品(陰性對照)則無相應(yīng)條帶，表明各世代轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中均表達出hLYZ蛋白質(zhì)。

圖2 轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊乳汁中表達產(chǎn)物的Western-blot檢測圖Fig.2 Western-blot result for hLYZ in transgenic goat milk

2.3.2 轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中hLYZ的ELISA檢測采用ELISA法測定轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中hLYZ含量，ELISA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為 0 μg/ml、0.093 μg/ml、0.187 μg/ml、0.375 μg/ml、0.750 μg/ml、1.500 μg/ml、3.000 μg/ml、6.000 μg/ml;待測乳汁樣品稀釋16 000倍，每個樣品2個重復(fù)?？瞻讓φ諡镋IA Diluent稀釋液(試劑盒提供)，陰性對照為普通奶山羊乳汁，陽性對照為rhLYZ標(biāo)準(zhǔn)品。檢測結(jié)果顯示，待測樣品各孔吸光度均在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，且重復(fù)性較好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品各孔OD450值與濃度梯度值，以吸光度為Y軸，以濃度為X軸，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為:Y=d+(ad)/［1+(x/c)^b］;式中:參數(shù) a=0.019，參數(shù) b=－0.958，參數(shù) c=0.118，參數(shù) d=2.666;R2=0.995 5。結(jié)果(表2)顯示，G0、F1和 F23 個世代轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中hLYZ含量分別為3.46 g/L、2.28 g/L和 2.22 g/L。

表2 各世代轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中hLYZ表達量Table 2 HLYZ expression level in transgenic goat milk of each generation

3 討論

人溶菌酶在人體內(nèi)廣泛表達，其中人乳中含量為50～250 mg/L。采用DNA重組技術(shù)，利用原核或真核表達系統(tǒng)對人溶菌酶進行規(guī)?；a(chǎn)，最終獲得的人溶菌酶含量也不盡相同。酵母和霉菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)成分是人溶菌酶的最適作用底物之一，當(dāng)人溶菌酶在酵母或霉菌中表達時，人溶菌酶以活性形式存在，對酵母或霉菌細(xì)胞壁有溶解作用，從而影響工程菌的生長發(fā)育，最終降低表達水平［6］。以大腸桿菌為宿主生產(chǎn)人溶菌酶，產(chǎn)量在2 mg/L以下;以霉菌作為宿主生產(chǎn)人溶菌酶，產(chǎn)量可達到40 mg/L［14-15］。目前，利用哺乳動物體細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)人溶菌酶已成為現(xiàn)實。本研究轉(zhuǎn)基因山羊能夠利用乳腺特異、高效的表達人溶菌酶(hLYZ)，經(jīng)過3個世代的繁育，hLYZ基因能夠在山羊世代間遺傳，且獲得的轉(zhuǎn)基因子代羊只健康狀況良好，3個世代母羊乳汁中hLYZ蛋白質(zhì)平均表達量大于2.00 g/L。

hLYZ基因位于人類第12染色體上，呈顯性效應(yīng)遺傳［6］。本研究G0代轉(zhuǎn)基因山羊是采用體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得的攜帶有hLYZ基因的雜合子母羊。通過常規(guī)育種方法獲得的子代hLYZ整合雜合子羊，乳汁中能穩(wěn)定表達hLYZ蛋白質(zhì)，表明該外源基因在山羊染色體上的遺傳效應(yīng)與在人類染色體上相似。hLYZ基因的轉(zhuǎn)入，未對轉(zhuǎn)基因羊群的繁殖能力產(chǎn)生顯著影響，表明該基因能夠在山羊群體世代間遺傳和穩(wěn)定表達。

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