汪 偉， 何孔旺， 倪艷秀， 呂立新， 周俊明， 張雪寒， 俞正玉， 茅愛華， 溫立斌，王小敏， 李 彬， 郭容利

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014)

豬鏈球菌(Streptococcus suis)為革蘭氏陽性菌，是豬的一種重要病原體，可引起腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎和肺炎等［1］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)35個血清型(1 ～34型和1/2 型)［2］，最近有報道將 32、34 兩型重新歸類為鼠口腔鏈球菌(Streptococcus orisratti)［3］。其中豬鏈球菌2型(SS2)是一種重要的人畜共患病病原，人感染SS2主要引起腦膜炎，并伴隨敗血癥、心內(nèi)膜炎和鏈球菌中毒休克綜合征(STSS)［4］，最終導(dǎo)致死亡。在中國江蘇省部分地區(qū)(1998 ～1999 年)［5］及四川省(2005 年)均暴發(fā)過人感染 SS2 至死事件［6］。

目前關(guān)于SS2確切的致病機制仍不清楚［1］，但已經(jīng)證明某些炎性和傳染性疾病與細胞因子的過量產(chǎn)生有關(guān)。特別是一些炎癥相關(guān)細胞因子，如 IL－1β［7］、IL－18［8］、IL－8［9］等 促 炎癥細胞因子。IL－12是這些因子的誘導(dǎo)劑并協(xié)同參與炎癥、介導(dǎo)與臨床疾病的惡化、多器官系統(tǒng)衰竭及休克性死亡相關(guān)的反應(yīng)［10］。革蘭氏陽性細菌的細胞壁成份是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要物質(zhì)［11］。盡管單核吞噬細胞在腦膜炎、敗血癥等致病機制中起重要作用，但SS2與豬源單核細胞之間的作用及誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞因子的研究并不多。

3D4/21 豬肺泡巨噬細胞是豬肺泡巨噬細胞的體外傳代細胞系，在體外已喪失了吞噬功能，但仍保留細胞因子分泌的功能，其作為研究SS2細胞因子轉(zhuǎn)錄的模型細胞已有報道［12］。本試驗就SS2不同毒力菌株及impdh缺失株對3D4/21細胞的炎癥相關(guān)細胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄的影響進行研究，旨在為SS2致病機制提供一個可能的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Todd hweitt bacto(THB)培養(yǎng)基(美國BD公司產(chǎn)品)，DMEM細胞培養(yǎng)液(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)，3D4/21豬肺泡巨噬細胞(美國ATCC產(chǎn)品)，細胞RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)，AMV反轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司產(chǎn)品)，RNA酶抑制劑(大連TaKaRa公司產(chǎn)品)，Oligo(dT)15(大連TaKaRa公司產(chǎn)品)，SYBR Premix ex Taq(大連TaKaRa公司產(chǎn)品)，Rotor－gene 6000定量PCR儀。

1.2 菌株來源

試驗所用的 SS2菌株［ZY05719、ZY05719(△impdh)、HA0609、CS100322－1］均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所人獸共患病防控研究室保存，菌株來源見表1。

表1 試驗中所用菌株的生物來源、地理來源及致病性Table 1 Host of origin，geographic origin and pathogenicity of SS2 strains used in this study

1.3 細菌培養(yǎng)與處理

用THB平板復(fù)蘇菌株，37℃培養(yǎng) 24～48 h。挑單菌落接種于THB液體培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。取1 ml菌液6 000 g離心6 min，用無菌PBS洗2次。溶于PBS，60℃水浴45 min以滅活細菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ缁詈蟮木和縏HB平板，37℃培養(yǎng)48 h，以確定是否完全滅活。接種細胞之前用細胞培養(yǎng)液DMEM(10%血清)重懸細菌至1.0×109CFU/ml。

1.4 3D4/21豬肺泡巨噬細胞的培養(yǎng)

3D4/21 豬肺泡巨噬細胞(以下簡稱3D4/21細胞)是豬肺泡巨噬細胞的體外傳代細胞系，培養(yǎng)于含10%血清的DMEM中，長至單層細胞。將已長滿單層的細胞用細胞培養(yǎng)液制成細胞懸液(細胞密度為2.0×105CFU/ml)培養(yǎng)于24孔細胞板，每孔1 ml。置 37 ℃、5%CO2下培養(yǎng) 12 h。

1.5 接種

將24孔板上的3D4/21細胞用DMEM洗2次后，每孔接種 SS2細菌懸液 100 μl，補加 DMEM(10%血清)900 μl。800 g、25 ℃離心10 min。同時預(yù)留不含SS2細菌的3D4/21細胞，作為細胞因子自然轉(zhuǎn)錄對照組。每個菌株3個重復(fù)。置37℃、5%CO2下分別作用 6 h、12 h 和24 h。

1.6 細胞RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

在不同接種時間點取出細胞板，按Trizol說明書提取細胞總RNA。以O(shè)ligo(dT)15作為下游引物，應(yīng)用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。20 μl反轉(zhuǎn)錄體系:取 Oligo(dT)15(25 pmol/μl)2.0 μl，加入10.0 μl總 RNA，72 ℃ 10 min，冰浴 5 min 后，加入5 × 反轉(zhuǎn)錄緩沖液 4.0 μl、dNTP(10 mmol/L)2.0 μl、RNA 酶抑制劑(40 U/μl)1.0 μl、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/μl)1.0 μl，42 ℃ 反轉(zhuǎn)錄 1 h，95 ℃ 5 min 滅活后置－20℃冰箱備用。

1.7 熒光定量PCR法檢測樣品各細胞因子的cDNA拷貝數(shù)

用熒光定量 PCR 方法［10，13］檢測各細胞因子cDNA 拷貝數(shù)。Real－time PCR 20.0 μl反應(yīng)體系:2 ×SYBR Premix ex Taq 10.0 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μl，模板 1.0 μl，ddH2O 8.2 μl。反應(yīng)程序:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 30～60 s(表2)，40個循環(huán)。每一循環(huán)結(jié)束時讀取熒光信號?？傃h(huán)結(jié)束后，加入熔解曲線分析步驟。將各細胞因子基因的拷貝數(shù)除以同一樣本中β-actin基因的拷貝數(shù)，獲得一個相對比值，以對照組相對比值計為1，求出刺激組與對照組的倍比值(該值計為r)，用以表示相應(yīng)細胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

表2 各細胞因子和管家基因β-actin熒光定量PCR擴增的引物及條件Table 2 Primers and conditions for real-time PCR to amplify cytokines and housekeeping gene β-actin

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

菌株與對照組采用r值比較，r＞2為上調(diào)轉(zhuǎn)錄，r＜0.5為下調(diào)轉(zhuǎn)錄，r＞5時為過度上調(diào)(即過量轉(zhuǎn)錄)。

菌株之間數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用FC(倍數(shù)改變量)表示，F(xiàn)C＞2或FC＜0.5表明倍數(shù)改變有意義。

2 結(jié)果

細胞因子轉(zhuǎn)錄動力學(xué)結(jié)果顯示，SS2各菌株刺激3D4/21 細胞后 IL-1β、IL-18、IL-8、IL-12 和 IL-10的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的變化，大小與刺激時間有關(guān)(圖1)。

2.1 SS2病菌對3D4/21細胞IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

IL－1β是一種重要的促炎癥細胞因子，在介導(dǎo)細菌感染后機體的炎癥反應(yīng)中起重要作用。4株SS2病菌在刺激3D4/21細胞6 h后均可以誘導(dǎo)IL-1β mRNA上調(diào)轉(zhuǎn)錄(r＞2);12 h均恢復(fù)至穩(wěn)定狀態(tài)(1＜r＜2);24 h后ZY05719仍誘導(dǎo)上調(diào)轉(zhuǎn)錄，HA0609誘導(dǎo)下調(diào)轉(zhuǎn)錄(r＜0.5)，另外2株ZY05719(△impdh)和CS100322－1誘導(dǎo)處于穩(wěn)定狀態(tài)(圖1)。說明強毒株比低毒株和無毒株誘導(dǎo)IL-1β的持續(xù)期更長，可長時間刺激IL-1β的產(chǎn)生，刺激機體的炎癥反應(yīng)。

圖1 SS2病菌刺激對3D4/21豬肺泡巨噬細胞的細胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.1 Influence of mRNA level of Streptococcus suis 2 triggered cytokines responses in porcine alveolar macrophages cell lines 3D4/21

2.2 SS2病菌對3D4/21細胞IL-18 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

IL－18也是一種促炎癥細胞因子，與IL－1β同屬一個家族。4株SS2病菌在刺激3D4/21細胞6 h后，ZY05719和 ZY05719(△impdh)均誘導(dǎo) IL-18 mRNA上調(diào)轉(zhuǎn)錄，且 ZY05719誘導(dǎo)過度轉(zhuǎn)錄(r＞5)，轉(zhuǎn)錄水平高于其他菌株(FC＞2)，菌株HA0609和CS100322－1誘導(dǎo)處于穩(wěn)定狀態(tài)。刺激12 h后，除ZY05719(△impdh)誘導(dǎo)IL-18 mRNA上調(diào)轉(zhuǎn)錄，其他菌株誘導(dǎo)均處于穩(wěn)定狀態(tài)。24 h后，ZY05719、ZY05719(△impdh)、HA0609誘導(dǎo)上調(diào)轉(zhuǎn)錄，CS100322－1誘導(dǎo)仍保持穩(wěn)定，但誘導(dǎo)上調(diào)的3株之間沒有差異(1＜FC＜2)。說明強毒株能夠強烈刺激IL-18 mRNA的轉(zhuǎn)錄，impdh缺失株及無毒株HA0609也能夠刺激IL-18 mRNA轉(zhuǎn)錄，但低毒株CS100322－1對IL-18 mRNA的轉(zhuǎn)錄沒有明顯影響。

2.3 SS2病菌對3D4/21細胞IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

IL－8 與 IL－1β 和 IL－18 一樣，是一種重要的促炎癥細胞因子。SS2病菌在刺激3D4/21細胞6 h后，ZY05719(△impdh)誘導(dǎo) IL-8 mRNA上調(diào)轉(zhuǎn)錄，CS100322－1出現(xiàn)一定程度的下調(diào)轉(zhuǎn)錄，而ZY05719與HA0609誘導(dǎo)保持穩(wěn)定狀態(tài)。12 h后，ZY05719明顯誘導(dǎo)上調(diào)轉(zhuǎn)錄(r＞5)，且遠高于其他菌株(FC＞7);HA0609也誘導(dǎo)上調(diào)轉(zhuǎn)錄，ZY05719(△impdh)和CS100322－1誘導(dǎo)保持穩(wěn)定。24 h后，ZY05719誘導(dǎo)仍保持過度上調(diào)(r＞5)，且高于其他3株(FC＞5)。說明總體上強毒株能夠長時間誘導(dǎo)強烈的IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄，且明顯強于其他3株;ZY05719(△impdh)及無毒株HA0609同樣能夠誘導(dǎo)IL-8 mRNA的轉(zhuǎn)錄，并持續(xù)較長時間;低毒株CS100322－1不能誘導(dǎo)IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄，且有一定程度的抑制。

2.4 SS2病菌對3D4/21細胞IL-12 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

IL－12 是 IL－1β、IL－18 及 IL－8 等促炎癥細胞因子的誘導(dǎo)劑并協(xié)同參與炎癥反應(yīng)。在測試的3個時間點內(nèi)，ZY05719(△impdh)與 CS100322－1對 IL-12 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯影響(1＜r＜2)，ZY05719和HA0609表現(xiàn)為誘導(dǎo)IL-12 mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨刺激時間延長呈上升趨勢。24 h后ZY05179誘導(dǎo)明顯上調(diào)(r＞5)，且遠遠高于 impdh缺失株(FC ＞10)，也高于菌株 HA0609和 CS100322－1。說明強毒株更易于誘導(dǎo)IL-12 mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而有利于促炎癥細胞因子的轉(zhuǎn)錄，這與前面結(jié)果中ZY05719對IL-1β、IL-18和IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于其他菌株一致。

2.5 SS2病菌對3D4/21細胞IL-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

IL－10屬于抗炎癥細胞因子，其作用是對抗機體的炎癥反應(yīng)。在測試的3個時間點內(nèi)，ZY05719誘導(dǎo)IL-10 mRNA一直處于上調(diào)轉(zhuǎn)錄，原因可能是ZY05719誘導(dǎo)促炎癥細胞因子過度轉(zhuǎn)錄，引發(fā)了IL-10 mRNA上調(diào)，以維持細胞自身的穩(wěn)態(tài)，抑制過度炎性因子產(chǎn)生，是細胞的一種自我保護反應(yīng)。HA0609誘導(dǎo)總體處于下調(diào)，表明HA0609誘導(dǎo)炎癥細胞因子雖上調(diào)轉(zhuǎn)錄，但未過度轉(zhuǎn)錄，維持低量的IL－10將有利于炎癥細胞因子的產(chǎn)生，在體內(nèi)有利于適量的炎癥反應(yīng)，以清除細菌。CS100322－1誘導(dǎo)則處于穩(wěn)定狀態(tài)，表明CS100322－1促炎癥細胞因子基本沒有大的變化，使得IL－10的變化不明顯，將不利于炎癥反應(yīng)的進行和細菌的清除，細菌可長時間存活于血液，引發(fā)敗血癥。ZY05719(impdh)誘導(dǎo)與其他3株表現(xiàn)不同，刺激3D4/21細胞開始時IL-10 mRNA上調(diào)，然后穩(wěn)定，最后下調(diào)。其原因可能是在刺激6 h時IL-1β、IL-18、IL-8的mRNA均上調(diào)轉(zhuǎn)錄，而在12 h和24 h部分因子出現(xiàn)下調(diào)，進而影響到IL-10 mRNA的轉(zhuǎn)錄。推測其感染情況:ZY05719(impdh)開始刺激3D4/21細胞時，產(chǎn)生的促炎癥細胞因子與抗炎癥細胞因子達到了平衡，動物不發(fā)生過度的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為不發(fā)病;隨著時間的推移，IL－10水平降低，而多種促炎癥細胞因子仍然產(chǎn)生，引發(fā)持續(xù)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致動物發(fā)病死亡。

3 討論

本研究證明了SS2病菌可以影響3D4/21細胞IL-1β、IL-18、IL-8、IL-12 及 IL-10 mRNA 的轉(zhuǎn)錄，且這種影響隨刺激時間的長短而變化。這些細胞因子可能在機體感染SS2后，在參與或介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起重要作用。但SS2哪些毒力因子參與刺激細胞因子及炎癥反應(yīng)仍沒有完全明確。本研究中SS2具有體外刺激免疫細胞的細胞因子轉(zhuǎn)錄的能力，這意味著在機體內(nèi)存在著免疫細胞對SS2的某些成分產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并由此激發(fā)各種免疫反應(yīng)并產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)與全身性感染。本研究中發(fā)現(xiàn)不同野生SS2菌株的促炎癥細胞因子及抗炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄與菌株介導(dǎo)的炎癥存在某些內(nèi)在聯(lián)系，對了解SS2體內(nèi)感染也有著積極意義。

許多研究通過無莢膜包裹突變株已清楚地指出細菌細胞壁成分是主要的細胞因子誘導(dǎo)物，但其機制仍不清楚。例如CPS能夠以不依賴MyD88方式特異性誘導(dǎo)產(chǎn)生 MCP－1［14］。Segura 等［15］人采用小鼠巨噬細胞模型，發(fā)現(xiàn)SS2與細胞共刺激后可產(chǎn)生促炎癥細胞因子IL－6和TNF－α，且對細菌濃度和時間有依賴性，并發(fā)現(xiàn)SS2純化的EF和SLY致病因子不能刺激細胞因子的釋放。Dominguez－Punaro等［16］在老鼠體內(nèi)感染SS2 24 h后觀察到高水平的全身性細胞因子 TNF－α、IL－6、IL－12、IFN－γ 及趨化因子 CCL2/MCP－1、CXCL1/KC 和 CCL5/RANTE，認為這是動物早期突然死亡的原因。Vanier等［17］認為SS能夠誘導(dǎo)炎性介導(dǎo)加劇釋放而導(dǎo)致白細胞大量積聚并釋放炎性介質(zhì);但是SS可調(diào)控這種反應(yīng)，通過積極降低趨化因子和延緩嗜中性粒細胞積聚至炎癥部位，以提高其存活能力。

豬鏈球菌2型無論是體內(nèi)還是體外刺激炎癥相關(guān)細胞因子產(chǎn)生，都是一個復(fù)雜的、受多種因素影響的過程。尋找一個適當?shù)脑囼災(zāi)Ｐ秃脱芯糠椒ǎ瑢α私庠摼w內(nèi)和體外感染機制是十分重要的。多國學(xué)者試圖通過研究體內(nèi)或體外相關(guān)細胞因子(主要炎癥相關(guān)細胞因子)的變化，來進一步了解SS2的致病機制。但目前對SS2真正的致病機制仍未有一個明確的定論，需要繼續(xù)研究，以便對該病原菌的預(yù)防和治療提供有效的策略。

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