周 瓊， 黃東林， 祁靜霞， 吳海燕， 楊麗芬，2， 施敏娟，3， 楊益眾

(1.揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇 揚州 225009;2.江蘇揚農(nóng)化工集團有限公司，江蘇 揚州 225009;3.南通大學醫(yī)學院，江蘇 南通 226001)

亞洲玉米螟［Ostrinia furnacalis(Güenée)］是中國玉米生產(chǎn)上最重要的害蟲，上世紀70年代以來對棉花的為害逐年加重［1-3］，成為長江中下游和黃河流域玉米、棉花混作區(qū)為害棉花的重要鉆蛀性害蟲［4］。轉基因棉花的大面積推廣也成為控制亞洲玉米螟為害的重要手段［5］。但Bt作物的持續(xù)大面積種植，使多化性害蟲連續(xù)暴露在Bt毒蛋白質的作用下，增加了選擇壓，耐受性的群體得到發(fā)展，以致在群體水平上產(chǎn)生害蟲抗性［6］。研究結果表明，許多害蟲對Bt均能產(chǎn)生抗性［7-8］。但抗性的機理仍在不斷探討過程中。

解毒酶和保護酶是昆蟲體內(nèi)的主要酶系，乙酰膽堿酯酶是神經(jīng)突觸部位清除乙酰膽堿、維護神經(jīng)正常傳導的重要酶類，其活性是衡量昆蟲神經(jīng)生理活性的主要指標［9］。而許多殺蟲劑是以乙酰膽堿酯酶為靶標，因此該酶與昆蟲的解毒作用有密切的關系。昆蟲體內(nèi)的解毒酶系主要有氧化酶、還原酶、水解酶3種代表性酶類和轉移酶4類，而水解酶中的酯酶和轉移酶類的谷胱甘肽轉移酶對分解外源毒物，維持正常的生理代謝起到很重要的作用［10］。已有研究證實，昆蟲體內(nèi)的解毒酶活性受到Bt毒蛋白質的影響而發(fā)生變化，可能與蟲體對毒蛋白質的代謝及抗性產(chǎn)生有關［11-12］。而超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)則是普遍存在于生物體內(nèi)的2種重要的防御氧化損傷的保護酶。SOD的作用是把O2·－歧化成 H2O2，H2O2能與 O2·－形成毒性更強的氫氧自由基(HO·)，但細胞內(nèi)的CAT可以將H2O2轉化成水，生物體內(nèi)的幾種保護酶處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，使自由基維持在一個低水平，起到保護生物機體的作用［13］。因此，研究Bt毒蛋白質與亞洲玉米螟體內(nèi)相關酶活的關系，不但可以了解Bt轉基因棉對亞洲玉米螟的毒性作用，還可以探尋該害蟲產(chǎn)生抗性的可能性，也為更好地利用轉基因棉控制玉米螟提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 亞洲玉米螟來源于揚州大學實驗農(nóng)牧場玉米田。第一代室內(nèi)試驗用采集于玉米上的卵;第二、三代試驗蟲源分別來自田間捕捉的上代成蟲，在室內(nèi)常溫條件下，放置于高10 cm直徑7 cm的罐頭瓶內(nèi)飼喂，瓶內(nèi)壁覆以蠟紙，頂部用窗網(wǎng)封住，并用牛皮筋扎緊，每天早中晚3次用蘸有10%蜜糖水的脫脂棉放在窗網(wǎng)上供成蟲補充營養(yǎng)，產(chǎn)卵后用于試驗。

1.1.2 Cry1Ac毒蛋白質及人工飼料的配制 20%Cry1Ac毒蛋白質粉劑由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。分別稱取20%Cry1Ac毒蛋白質粉劑0.005 350 g、0.013 375 g、0.021 400 g 和0.029 425 g，用50 mmol/L Na2CO3溶液溶解并用蒸餾水定容至100 ml，置4℃冰箱保存。人工飼料的配制參照周大榮等［14］的方法加以改進，待配好的飼料冷卻至60℃左右，加入10 ml溶解好的Cry1Ac蛋白質，充分混勻，配制成 200 ng/g、500 ng/g、800 ng/g、1 100 ng/g及對照(不加Cry1Ac蛋白質)5種不同Cry1Ac含量的人工飼料，冷卻后置4℃冰箱保存。

1.1.3 幼蟲飼喂和樣本收集 亞洲玉米螟初孵幼蟲分別飼喂在裝有不同Cry1Ac含量人工飼料的高10 cm直徑7 cm的罐頭瓶內(nèi)。收集生長整齊的3齡幼蟲13頭及5齡幼蟲3頭放入離心管中，重復3次。以上供試幼蟲均放在－80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 試驗條件 試驗于溫度 29℃ ±1℃、相對濕度 85% ±5%、光周期16∶8(L∶D)的光照箱(RXZ智能型人工氣候箱，寧波江南儀器廠生產(chǎn))內(nèi)進行。

1.1.5 主要供試藥劑及試劑盒 碘化硫代乙酰膽堿(ACTHI)、5，5-二硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)、毒扁豆堿、α-乙酸萘酯、α-萘酚、固藍B鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、丙酮、無水乙醇、GSH-ST試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒、Bradford蛋白質定量試劑盒。

1.2 乙酰膽堿酯酶及解毒酶測定方法與操作步驟

1.2.1 酶源的制備 將試蟲樣品導入勻漿器中，加入1 ml pH 7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液(含0.1%TritonX-100)，冰浴勻漿。勻漿液在4℃下10 000 g離心15 min，取上清液作為酶源。每個處理重復3次，在酶標儀下(Power wave XS酶標儀，美國Bio-TeK公司產(chǎn)品)分析酶活性。

1.2.2 乙酰膽堿酯酶(AchE)活性測定 參照Ellman等［15］的方法并加以改進。于412 nm下測OD值，掃描20 min，1 min讀1次數(shù)，計算AchE活性。

1.2.3 α-乙酸萘酯酶活性測定 參照 Van［16］的方法并加以改進。室溫下放置10 min，于600 nm處比色，測OD值。以α-萘酚作標準曲線。

1.2.4 羧酸酯酶(CarE)活性測定 參照Van［16］的方法并加以改進。室溫下放置10 min，于600 nm處比色，測OD值。

1.2.5 谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)活性測定 按GST測定試劑盒的說明書進行檢測。

1.3 保護酶測定方法與操作步驟

1.3.1 酶源的制備 將試蟲樣品導入勻漿器中，以生理鹽水作介質，加入1 ml 67.25%的生理鹽水，冰浴勻漿，勻漿液在4℃下10 000 g離心15 min。取上清液作為酶源。每個處理重復3次，在酶標儀下分析酶活性。

1.3.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定 按總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒說明書進行檢測。

1.3.3 過氧化氫酶(CAT)活性測定 按過氧化氫酶(CAT)測試盒說明書進行檢測。

1.4 可溶性蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍G-250法測定，以牛血清蛋白質(BSA)為標準蛋白質。操作步驟按Bradford蛋白質定量試劑盒說明書進行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應用DPS軟件中單因素試驗統(tǒng)計的Tukey氏固定極差測驗法對試驗數(shù)據(jù)進行多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 Cry1Ac毒蛋白質對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的影響

表1表明，不同含量Cry1Ac人工飼料對亞洲玉米螟幼蟲乙酰膽堿酯酶活性有顯著影響(3齡幼蟲:df=4，F(xiàn)=16.05，P＜0.05;5 齡幼蟲:df=4，F(xiàn)=4.19，P＜0.05)。乙酰膽堿酯酶的活性除200 ng/g毒蛋白質的處理外均高于對照，且隨著毒蛋白質含量的升高而上升。1 100 ng/g處理的3齡幼蟲該酶的活性分別比800 ng/g、500 ng/g、200 ng/g的處理及對照顯著升高了 11.19%、17.03%、23.28%、19.85%，800 ng/g處理的酶活性比200 ng/g的處理顯著升高了10.88%。1 100 ng/g處理的5齡幼蟲酶活性比200 ng/g的處理顯著升高19.24%。

表1 取食不同含量Cry1Ac人工飼料的亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性變化Table 1 Changes in the activitiy ofacetylcholinesterase in Ostrinia furnacalis larvae feeding on artificial diets with different contents of Cry1Ac

2.2 Cry1Ac蛋白質對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)解毒酶活性的影響

如圖1所示，亞洲玉米螟取食不同含量Cry1Ac毒蛋白質的人工飼料后，對α-乙酸萘酯酶活性影響顯著(3齡幼蟲:df=4，F(xiàn)=107.58，P＜0.05;5齡幼蟲:df=4，F(xiàn)=26.61，P ＜0.05)。200 ng/g Cry1Ac毒蛋白質處理時，3齡幼蟲體內(nèi)的α-乙酸萘酯酶活性與對照相比有所上升，隨著毒蛋白質含量的升高，α-乙酸萘酯酶活性逐漸被抑制;500 ng/g處理時α-乙酸萘酯酶活性比200 ng/g處理時顯著降低了11.57%;到800 ng/g處理時，則α-乙酸萘酯酶活性比對照和200 ng/g處理時分別顯著降低了14.90%和18.81%;1 100 ng/g處理時，α-乙酸萘酯酶活性比對照和 200 ng/g、500 ng/g、800 ng/g處理時分別顯著降低了48.59%、50.95%、44.53%、39.59%。5齡幼蟲體內(nèi)α-乙酸萘酯酶活性也有類似的變化趨勢，但只有在1 100 ng/g處理時，α-乙酸萘酯酶活性比對照、200 ng/g、500 ng/g、800 ng/g 處理分別顯著降低了39.15%、43.74%、34.04%、38.54%。

圖1 取食不同含量Cry1Ac人工飼料后亞洲玉米螟體內(nèi)α-乙酸萘酯酶活性變化Fig.1 Changes of the activity of α-naphthylacetate esterase in-Ostrinia furnacalis larvea feeding on artificial diets with different contents of Cry1Ac

不同含量Cry1Ac毒蛋白質處理的亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)羧酸酯酶活性與對照相比均被抑制(3齡幼蟲:df=4，F(xiàn)=5.93，P ＜0.05;5齡幼蟲:df=4，F(xiàn)=6.34，P ＜ 0.05)。500 ng/g、800 ng/g和1 100 ng/g毒蛋白質處理時，3齡幼蟲該酶活性分別比對照顯著降低了23.53%、24.56%和25.44%;1 100 ng/g處理時，5齡幼蟲羧酸酯酶活性分別比對照和200 ng/g處理顯著減少了30.00%和25.32%(圖2)。

圖2 取食不同含量Cry1Ac人工飼料后亞洲玉米螟體內(nèi)羧酸酯酶活性變化Fig.2 Changes of the activity of carboxylesterase in Ostrinia furnacalis larvae feeding on artificial diets with different contents of Cry1Ac

亞洲玉米螟不同齡期的幼蟲在取食不同含量Cry1Ac人工飼料后，谷胱甘肽-S-轉移酶的活性受到顯著影響(3齡幼蟲:df=4，F(xiàn)=5.77，P＜0.05;5齡幼蟲:df=4，F(xiàn)=3.61，P＜0.05)。3齡幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉移酶的活性除200 ng/g Cry1Ac處理外均低于對照，500 ng/g、800 ng/g和1 100 ng/g Cry1Ac 處理分別比對照降低了22.62%、23.18%、24.50%，分別比200 ng/g Cry1Ac處理顯著降低了29.57%、30.08%、31.28%。1 100 ng/g Cry1Ac處理的5齡幼蟲體內(nèi)該酶活性比對照顯著降低了20.04%(圖3)。

圖3 取食不同含量Cry1Ac人工飼料后亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉移酶活性變化Fig.3 Changes of the activity of glutathione-S-transferase in-Ostrinia furnacalis larvea feeding on artificial diets with various contents of Cry1Ac

2.3 Cry1Ac毒蛋白質對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)保護酶活性的影響

從表2可以看出，Cry1Ac毒蛋白質處理的亞洲玉米螟3齡幼蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶活性受到顯著影響(df=4，F(xiàn)=6.27，P ＜0.05)，500 ng/g和 800 ng/g Cry1Ac處理時分別比對照顯著升高了43.78%和42.26%;5齡幼蟲也有相同的變化趨勢，但差異不顯著(df=4，F(xiàn)=1.81，P ＞0.05)。

表2 取食不同含量Cry1Ac人工飼料后亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)保護酶活性變化Table 2 Changes in the activities of two protective enzymes in Ostrinia furnacalis larvae feeding on artificial diets with different contents of Cry1Ac

與超氧化物歧化酶活性變化相反，隨著Cry1Ac毒蛋白質含量的增加過氧化氫酶活性逐漸下降(3齡幼蟲:df=4，F(xiàn)=14.82，P＜0.05;5齡幼蟲:df=4，F(xiàn)=9.01，P ＜0.05)。其中 500 ng/g、800 ng/g和1 100 ng/g Cry1Ac處理的3齡幼蟲該酶活性分別比對照顯著降低19.93%、33.39%、32.61%;1 100 ng/g Cry1Ac處理的5齡幼蟲該酶活性分別比對照及200 ng/g Cry1Ac處理的顯著降低45.56%和45.12%。

3 討論

昆蟲可以通過改變自身解毒酶或靶標酶的特性等多種途徑以適應寄主植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物［17］，解毒酶的變化反過來再改變其對殺蟲劑的敏感性。轉基因作物所表達的殺蟲毒蛋白質作為一種導入性外源毒素，同植物代謝的次生物質和化學殺蟲劑一樣，也可以引起昆蟲體內(nèi)的相關解毒酶系和保護酶系等的活性變化，一方面對昆蟲的持續(xù)作用可能會破壞其生理生態(tài)平衡，導致內(nèi)部穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂，從而殺死害蟲;另一方面也可能誘導蟲體產(chǎn)生一定的防御機制，進而影響轉基因植物的殺蟲效果，甚至導致害蟲的抗性發(fā)展等。大量的研究已證明了類似的推斷［12，18-19］。

一些研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲體內(nèi)的各種酶活性與毒蛋白質關系不顯著。丁雙陽等的研究結果表明在飼喂轉Bt基因楊樹葉片后，美國白蛾幼蟲中腸乙酰膽堿酯酶活性與對照相比差異不顯著［20］。楊進研究發(fā)現(xiàn)轉雙價基因棉SGK321對斜紋夜蛾3齡幼蟲體內(nèi)的α-乙酸萘酯酶和谷胱甘肽-S-轉移酶的活性與對照間差異均不明顯［21］。劉旭的研究結果表明在取食轉SCK/Cry1Ac毒蛋白質基因稻谷后，米蛾幼蟲體內(nèi)的谷胱甘肽-S-轉移酶的活性與對照性相比無顯著差異［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，在取食含有Cry1Ac毒蛋白質粉劑的人工飼料后，亞洲玉米螟3齡幼蟲體內(nèi)的α-乙酸萘酯酶、羧酸酯酶以及谷胱甘肽-S-轉移酶的活性受到一定的抑制，且隨著毒蛋白質含量的升高，與對照相比表現(xiàn)出顯著的抑制作用，而在200 ng/g毒蛋白質下，α-乙酸萘酯酶和谷胱甘肽-S-轉移酶的活性均較對照有所升高。徐艷聆等也發(fā)現(xiàn)取食轉Bt基因玉米48 h后亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)的α-乙酸萘酯酶、谷胱甘肽S-轉移酶活性明顯低于對照，而乙酰膽堿酯酶活性顯著高于對照，推斷乙酰膽堿酯酶可能與玉米螟對Bt毒蛋白質的抗性有關［12］。因此Bt毒蛋白質與昆蟲體內(nèi)酶活的關系還有待進一步論證。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著毒蛋白質含量的升高，亞洲玉米螟幼蟲SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在1 100 ng/g毒蛋白質含量下SOD活性低于對照，而在其他毒蛋白質含量處理下均高于對照，而CAT活性呈現(xiàn)相反的趨勢，呈抑制作用。解娜等的研究結果表明在取食Cry1Ac毒蛋白質后，粘蟲體內(nèi)的SOD活性顯著升高，而CAT活性受到顯著抑制［23］，與本研究結果一致。在本試驗中，同一處理下，5齡幼蟲的保護酶活力要高于3齡幼蟲，而張巍等的研究結果表明在取食轉Cry1Ab/Cry1Ac基因水稻后，短時間內(nèi)(48 h)隨著取食時間的延長，Bt處理組的3齡幼蟲SOD活性先降低后上升，CAT活性在處理后期受到明顯抑制［24］，與本試驗的結果有所不同，這可能是長時間取食過程中的一個階段性變化。

轉Bt基因抗蟲作物中Bt蛋白質的表達及轉Bt基因植物里植物次生代謝物的含量均受到多種因素的影響［25-26］。本試驗沒有采用飼喂新鮮的轉基因植物組織來測定昆蟲體內(nèi)的酶系活性，而是直接將Bt-Cry1Ac毒蛋白質粉劑溶解后加入到人工飼料中進行室內(nèi)試驗。二者所引起的昆蟲相關響應機制的形式與過程是否完全相同不甚清楚，有可能是各研究的結果不盡相同的原因。

綜上所述，亞洲玉米螟取食不同亞致死含量的Cry1Ac人工飼料后，體內(nèi)的相關酶活性都發(fā)生了不同程度的變化。在較低Cry1Ac含量時，蟲體產(chǎn)生應激反應，部分解毒酶和保護酶活性被激活，對蟲體進行防御;隨著含量的增加，酶活性逐漸被抑制，顯著低于對照。而乙酰膽堿酯酶活性呈現(xiàn)升高的趨勢，這可能與昆蟲的抗性有關。毒蛋白質通過干擾SOD和CAT的活性，使蟲體自由基清除的動態(tài)平衡遭到破壞，擾亂正常的生理代謝，從而達到毒殺害蟲的作用。

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