劉艷荷， 方繼朝

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇 南京 210014;2.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

斜紋夜蛾核型多角體病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPV)隸屬于桿狀病毒科(Baculoviridae)，α 桿狀病毒屬 Alphabaculovirus［1］。SpltNPV在自然界存在多種分離株，具有豐富的基因型多態(tài)性。根據(jù)宿主范圍、生長(zhǎng)特性、多角體蛋白質(zhì)(Polyhedrin，polh)和DNA限制性酶切圖譜，Splt－NPV分為4組:AcNPV(Autographa californica NPV)型;SpliNPV(S.littoralis NPV)型:包括 SpliNPV－A和 SpliNPV－B;SpltNPV 特有基因型［2］。Kamiya 等［3］從日本采集17株病毒，空斑純化183個(gè)克隆，根據(jù)基因組DNA限制性酶切圖譜，分為A、B和C 3種基因型，A 型與 SliNPV－D［4］或 SliNPV－B［5］相似，B型與中國(guó)、日本、菲律賓的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中鑒定的SpltNPV 相似［6－8］，而C 型SpltNPV 與A 型和 B 型都不同，是一種新型病毒。

DNA解旋酶(Helicase)是生物生命現(xiàn)象中的一種重要的酶，催化dsDNA向ssDNA的轉(zhuǎn)換，并參與新生鏈的合成，在DNA修復(fù)和重組過(guò)程中都發(fā)揮著必不可少的作用。桿狀病毒DNA解旋酶除了參與DNA復(fù)制外，在決定桿狀病毒宿主域方面有著重要的作用［9］。AcNPV和家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori NPV，BmNPV)的 DNA解旋酶基因(helicase)是決定它們寄主范圍的重要基因［10－12］?？寺?AcNPV helicase，與 BmNPV 基因組DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，篩選出既能感染所有Ac－NPV寄主，又可以在家蠶中表達(dá)的雜交病毒，其helicase基因首(1～780 bp)尾(2 795～3 669 bp)與BmNPV對(duì)應(yīng)的DNA序列相同，但中間編碼的22個(gè)氨基酸與AcNPV相同［13］。本研究克隆Splt－NPV不同基因型克隆的helicase，對(duì)其核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行比較分析，為探討桿狀病毒宿主域擴(kuò)大機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)用病毒A6分離自SpltNPV埃及株，X8、X15和X17從來(lái)源于日本小笠原島的感病斜紋夜蛾幼蟲(chóng)中分離獲得，保存在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所作物蟲(chóng)害研究室(下文簡(jiǎn)稱本實(shí)驗(yàn)室)。病毒SeNPV以及克隆用大腸桿菌Escherichia coli TG1為本實(shí)驗(yàn)室保存;Taq酶購(gòu)自 TaKaRa公司，pGEM－T easy Vector、T4 DNA連接酶均購(gòu)自Promega(美國(guó))公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。離心機(jī)型號(hào)為Eppendorf 5417R和5810R。基因核苷酸序列測(cè)定在Invitrogen(美國(guó))公司進(jìn)行。

1.2 斜紋夜蛾的飼養(yǎng)

斜紋夜蛾幼蟲(chóng)自南京郊區(qū)甘藍(lán)地采集，帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)繁殖。幼蟲(chóng)飼養(yǎng)溫度(27±1)℃，相對(duì)濕度60%，光周期14∶10(L∶D)。幼蟲(chóng)以麥胚人工飼料在玻璃缸中群體飼養(yǎng)，4齡后以6孔板單頭飼養(yǎng);蛹放置于同樣的玻璃缸中，即將羽化時(shí)，移入成蟲(chóng)籠。成蟲(chóng)飼喂5%蔗糖水，以普通白紙置于籠壁供其產(chǎn)卵。

1.3 病毒的繁殖

通過(guò)幼蟲(chóng)口服接種繁殖病毒。將人工飼料切成小塊放入6孔板，滴加適量濃度病毒，每孔接入2～3頭4齡初期斜紋夜蛾幼蟲(chóng)，待其吃完病毒液飼料后再補(bǔ)充新鮮人工飼料。接毒幼蟲(chóng)飼養(yǎng)條件為:飼養(yǎng)溫度(27±1)℃，相對(duì)濕度60%，光周期14∶10(L∶D)。幼蟲(chóng)發(fā)病后收集染病蟲(chóng)體，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒基因組DNA的提取

將收集的病蟲(chóng)研磨，紗布過(guò)濾移除蟲(chóng)體碎屑。差速離心500 r/min 5 min，3 000 r/min 5 min，進(jìn)行多角體純化。將純化的多角體(POBs)109個(gè)懸浮于300 μl ddH2O，加入 100 μl 3 × DAS 堿裂解液(0.3 mol/L Na2CO3，0.5 mol/L NaCl，0.03 mol/L EDTA，pH 10.5)，37℃水浴10 min。待裂解液變清后，加入 200 μl TE(pH 8.0)，8 000 r/min離心 8 min。移出上清，加入蛋白酶K至終濃度200 μg/ml，45～50℃水浴2.5 h，再加入10%SDS至終濃度1%，繼續(xù)水浴30 min。苯酚抽提1次，苯酚∶氯仿∶異戊醇(體積比為25∶24∶1)抽提2次，再用無(wú)水乙醇沉淀基因組 DNA，干燥后溶解于 TE(pH 8.0)備用［14～16］。

1.5 PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆

參照 GenBank登錄的 SpltNPV(AF527603)、SpltNPV2(NC_011616)基因組全序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以方法1.4提取的病毒基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增，將所得片段克隆入pGEM－T easy Vector，測(cè)序拼接。

表1 試驗(yàn)中所用的PCR引物Table 1 PCR primers used in the experiments

1.6 核苷酸及氨基酸序列的比較

將所得的病毒helicase核苷酸序列和氨基酸序列與SpltNPV不同基因型及其他核型多角體病毒的helicase序列，利用Blast、Clustal W等軟件進(jìn)行同源性比較和分子進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SpltNPV不同基因型helicase的克隆

SpltNPV 3種基因型，A型和B型同源性較高，而C基因型與A型和B型的同源性較低，因此需要以SpltNPV和SpltNPV2基因組全序列為模板分別設(shè)計(jì)引物。SpltNPV helicase長(zhǎng)3 708 bp，編碼1 235個(gè)氨基酸;SpltNPV2 helicase長(zhǎng)3 654 bp，編碼1 217個(gè)氨基酸，為方便PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)2對(duì)引物。利用這些引物，分別以A6、X8、X15和X17病毒基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出8條1 800 bp左右的片段，克隆到pGEM－T easy Vector中測(cè)序(圖1)。進(jìn)行序列拼接后，得到 A6、X8、X15和 X174個(gè)病毒克隆 helicase的完整編碼區(qū)。

圖1 斜紋夜蛾核型多角體病毒A6、X8、X15和 X17株helicase PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Electrophoresis of helicase PCR products from SpltNPV A6，X8，X15，and X17isolates

2.2 SpltNPV不同基因型helicase的序列比較分析

SpltNPV 病毒克隆 A6、X8、X15的 helicase編碼區(qū)全長(zhǎng)相同，為3 756 bp，比SpltNPV helicase長(zhǎng)48 bp，分別在302～316 nt、333～360 nt和2 599～2 604 nt插入15 bp、27 bp 和 6 bp。SpltNPV helicase與 A6、X8、X15的helicase核苷酸序列相似性分別為89%、89%和91%，而A6和X8與X15的相似性都是97%，A6和 X8的相似性為99%。A6、X8和 X15的 helicase氨基酸序列全長(zhǎng)1 251個(gè)氨基酸，比SpltNPV helicase長(zhǎng)16個(gè)氨基酸，分別在95～104個(gè)氨基酸、117～121個(gè)氨基酸和837～838個(gè)氨基酸處插入9個(gè)、5個(gè)和2個(gè)氨基酸。A6、X8和 X15的 helicase與SpltNPV helicase氨基酸序列相似性均為93%，A6和X8與X15氨基酸序列相似性均為99%。

SpltNPV病毒克隆X17的helicase編碼區(qū)全長(zhǎng)3 699 bp，比 SpltNPV2 helicase 長(zhǎng) 45 bp，分別在2 167～2 178 nt、2 345～2 374 nt和2 483～2 485 nt處插入12 bp、30 bp和3 bp，核苷酸序列的相似性為90%。X17helicase比SeNPV helicase長(zhǎng)30 bp，在26～28 nt和2 491～2 493 nt處各缺失 3 bp，而在2 157 ～2 159 nt、2 172 ～ 2 186 nt、2 353 ～2 364 nt、2 389 ～2 391 nt、2 440 ～2 442 nt處分別插入 3 bp、15 bp、12 bp、3 bp 和 3 bp，核苷酸序列的相似性為82%。X17helicase全長(zhǎng)1 232個(gè)氨基酸，比SpltNPV2－h(huán)elicase長(zhǎng)15個(gè)氨基酸，在720～723個(gè)氨基酸、784～793個(gè)氨基酸和813個(gè)氨基酸處分別插入4個(gè)氨基酸、10個(gè)氨基酸和1個(gè)氨基酸，氨基酸序列相似性為92%。X17－h(huán)elicase比 SeNPV－h(huán)elicase多編碼10個(gè)氨基酸，在第8個(gè)氨基酸、812～813個(gè)氨基酸和827～830個(gè)氨基酸處分別缺失1個(gè)氨基酸、2個(gè)氨基酸和4個(gè)氨基酸，而在725～730個(gè)氨基酸、837～847個(gè)氨基酸處分別插入6個(gè)氨基酸、11個(gè)氨基酸，氨基酸序列相似性為83%。

A6、X8、X15的 helicase 和 X17的 helicase 同源性低，核苷酸序列相似性均為52%，氨基酸序列的相似性均為42%。

2.3 SpltNPV－h(huán)elicase的進(jìn)化分析

從GenBank下載33種NPV的helicase氨基酸序列(表2)，利用 Clustal W 和 Treeview(V.1.6.6)軟件，繪制SpltNPV不同基因型及克隆和下載的33種NPV的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。在進(jìn)化樹(shù)上SpltNPV不同基因型及克隆分別處于兩大分枝上:X17、Splt－NPV2、SeNPV和SfMNP處在一個(gè)分支;因SpliNPV的helicase序列在GenBank上沒(méi)有登錄，SpltMNP與分離自日本小笠原株的X8和X15、分離自埃及株的A6及LsNPV處在一個(gè)分支上，這與多角體蛋白質(zhì)基因核苷酸序列的進(jìn)化分析結(jié)果基本一致［17］。本試驗(yàn)克隆的A6和X8同源性高，在一個(gè)小的分支上，然后和X15匯合一個(gè)較大的分支，再與SpltNPV匯合在一起，最后與LsNPV構(gòu)成一個(gè)較大的分支。

圖2 SpltNPV 6種基因型及克隆和33種桿狀病毒helicase氨基酸序列的NJ進(jìn)化樹(shù)Fig.2 The NJ phylogenetic tree of 6 SpltMNPV genotypes and 33 nucleopolyhedrovirus based on helicase amino acid sequences

表2 進(jìn)化分析中所用SpltNPV不同基因型和其他33種NPV的helicase基因Table 2 Helicase genes of SpltMNPV genotypes and other 33 NPVs used in the phylogenetic analysis

3 討論

本研究克隆了 4株(A6、X8、X15和 X17)病毒的helicase基因，從同源性分析結(jié)果看，A6、X8、X15與SpltNPV同源性較高，核苷酸序列的相似性分別為89%、91%和89%，氨基酸序列的相似性都是99%。因?yàn)镾pliNPV的helicase基因在GenBank上沒(méi)有登錄，無(wú)法進(jìn)行同源性比較，因此單就helicase序列，無(wú)法判斷A6、X8、X15屬于 SpliNPV型(A基因型)或SpltNPV型(B基因型)。X17與SpltNPV2、SeNPV同源性較高，核苷酸序列的相似性分別為90%和82%，氨基酸序列的相似性分別為92%和83%，而與SpltNPV同源性較低，核苷酸序列的相似性為52%，氨基酸序列的相似性為42%，因此X17屬于SeNPV型(C基因型)。從進(jìn)化分析結(jié)果看，A6、X8和X15在同一大的分支，而X17與SpltNPV2和SeNPV在同一大的分支，這與以多角體蛋白質(zhì)基因核苷酸序列的進(jìn)化分析結(jié)果一致。在克隆的4株病毒helicase基因中，A6、X8、X15之間序列差異比較小，可能由于克隆的病毒株數(shù)較少，沒(méi)有包括與SpltNPV親緣關(guān)系最近的病毒株，也可能在自然界中，SpltNPV和SpliNPV發(fā)生同源重組，使得該基因逐漸趨于相似，如這兩種基因型的幾丁質(zhì)酶基因、核苷酸序列和氨基酸序列的相似性均為99%［18］。

SpltNPV2基因組全序列已被測(cè)定(NC_011616)，全長(zhǎng)148 634 bp，150 bp以上的 ORFs 149個(gè)，基因組比SpltNPV長(zhǎng)9 kb，多9個(gè)ORFs，兩者之間96個(gè)ORFs有同源性，氨基酸序列相似性平均為44.6%，基因順序存在很大差異。SpltNPV2比SeNPV基因組長(zhǎng)13 kb，但兩個(gè)病毒間133個(gè)ORFs具有同源性，氨基酸序列相似性平均76.5%，而且基因順序存在明顯一致性。雖然SpltNPV2與SpltNPV來(lái)源于相同的宿主。但是它們之間的同源性遠(yuǎn)不如SpltNPV2和 SeNPV 高［19］。X17是從日本小笠原采集的病毒株分離獲得，已對(duì)其部分基因進(jìn)行了克隆，發(fā)現(xiàn)其基因與SpltNPV2和SeNPV同源性高［17］。本試驗(yàn)以X17和SeNPV飼喂甜菜夜蛾幼蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)該病毒對(duì)甜菜夜蛾的感染率為44%，但甜菜夜蛾幼蟲(chóng)致死時(shí)間與感染斜紋夜蛾致死時(shí)間相當(dāng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于SeNPV感染甜菜夜蛾的致死時(shí)間。另外也有報(bào)道SpltNPV能夠侵染甜菜夜蛾的細(xì)胞核幼蟲(chóng)［20］。目前已證實(shí)DNA helicase是決定AcNPV和BmNPV宿主范圍的重要基因，但不同桿狀病毒之間，其宿主域決定機(jī)制不同。至于在SpltNPV中，helicase基因是否與病毒宿主域或侵染時(shí)間有關(guān)，還需要進(jìn)行基因刪除等試驗(yàn)進(jìn)一步研究確定。

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