劉 芳， 都立輝， 王道營， 徐為民， 霍貴成

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014;2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210003;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

乳酸菌被公認(rèn)為安全的食品級微生物，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛，并被用來外源表達(dá)某些功能物質(zhì)［1－4］。但乳酸菌的表達(dá)載體很少，尤其是具有特殊用途的表達(dá)載體更少，限制了乳酸菌生物工程的發(fā)展。目前應(yīng)用最廣泛的乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)是NICE(Nisin－controlled expression)系統(tǒng)，它是在乳鏈菌肽誘導(dǎo)下由nisA啟動子控制目的基因表達(dá)，并且需要nisR和nisK基因的存在［5］。雖然該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)外源物質(zhì)的高效表達(dá)［6］，但是由于大多數(shù)乳酸菌不攜帶nisR和nisK基因，需要在乳酸菌染色體上整合nisR和nisK基因或者使用雙質(zhì)粒系統(tǒng)，這限制了NICE系統(tǒng)的應(yīng)用。在乳酸菌內(nèi)進(jìn)行外源基因表達(dá)時(shí)也可選擇組成型表達(dá)載體，但這類載體的啟動子不受調(diào)控，菌株開始生長時(shí)，外源物質(zhì)也隨之表達(dá)，對菌株造成一些負(fù)擔(dān)或毒性，影響菌株的生長。因此，如果能夠找到一種自身調(diào)控的啟動子來構(gòu)建乳酸菌的表達(dá)載體，必將擴(kuò)展乳酸菌的應(yīng)用范圍。

根據(jù)已有研究，乳酸乳球菌MG1363含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件CodY，它能調(diào)控蛋白水解系統(tǒng)中相關(guān)基因的表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)支鏈氨基酸(包括異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸)的濃度增大時(shí)，CodY能夠結(jié)合到蛋白水解系統(tǒng)相應(yīng)基因操縱子的上游序列，從而控制這些基因的表達(dá)［7］。同時(shí)，研究還證實(shí)CodY能夠調(diào)節(jié)它自身的合成，并且也需要支鏈氨基酸結(jié)合到該蛋白質(zhì)的啟動子上［8］。因此，當(dāng)菌株生長到對數(shù)生長期，胞內(nèi)游離氨基酸尤其是支鏈氨基酸的濃度增大時(shí)，CodY開始表達(dá)。通過嗜熱鏈球菌基因組信息(NC_006449和NC_008532等)推斷，該菌內(nèi)也含有一個(gè)類似的調(diào)控蛋白CodY，但是對該蛋白質(zhì)在嗜熱鏈球菌中的調(diào)控機(jī)制還沒有深入的研究。由于嗜熱鏈球菌是酸奶發(fā)酵菌株，應(yīng)用潛力巨大，因此對嗜熱鏈球菌進(jìn)行研究有很重要的生產(chǎn)價(jià)值。

為了明確能否利用嗜熱鏈球菌CodY蛋白的啟動子來調(diào)控外源基因的表達(dá)，本試驗(yàn)擬首先克隆出CodY的啟動子，利用該啟動子和嗜熱鏈球菌內(nèi)源性質(zhì)粒的復(fù)制子構(gòu)建嗜熱鏈球菌用表達(dá)載體，然后以gusA基因?yàn)閳?bào)告基因，研究嗜熱鏈球菌來源的codY基因啟動子是否能夠調(diào)控下游基因的表達(dá)，旨在為嗜熱鏈球菌的生物工程研究提供新的研究方法和操作工具。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

大腸桿菌(E.coli DH5α)和嗜熱鏈球菌(KLDS 3.8501和KLDS 3.0503)來源于乳品工業(yè)微生物菌種保藏中心(KLDS－DICC);乳酸乳球菌 NZ9000購自荷蘭NIZO食品研究所;克隆載體pMD19－T simple購自寶生物工程(大連)有限公司;pNZ273由 Jean－Christophe Giard教授饋贈。

E.coli DH5α用LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng);乳酸乳球菌用GM17培養(yǎng)基(M17培養(yǎng)基外加0.5%葡萄糖)，30℃靜止培養(yǎng)。嗜熱鏈球菌用LM17培養(yǎng)基(M17培養(yǎng)基外加2%乳糖)，42℃靜止培養(yǎng)。氨芐青霉素、氯霉素在大腸桿菌中的使用濃度分別為 100 μg/ml和 25 μg/ml，氯霉素在乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌中的使用濃度都為5 μg/ml。

1.2 試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司;膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司;PCR引物的合成以及DNA序列的測定由上海生工生物工程有限公司完成;限制性核酸內(nèi)切酶 BglⅡ、PstⅠ、SalⅠ、SacⅠ、HindⅢ和 XhoⅠ，PrimeSTAR?HS DNA Polymerase購于寶生物工程(大連)有限公司;T4 DNA連接酶購于NEB公司;氯霉素和對硝基苯－β－D－葡萄糖酸(PNPG)購自 Sigma 公司;5－溴－4－氯－3－吲哚葡糖苷酸(X－Gluc)由Clontech公司提供;M17培養(yǎng)基購自BD公司，其余試劑為分析純。

1.3 嗜熱鏈球菌codY基因啟動子的擴(kuò)增

由在線啟動子分析軟件BDGP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預(yù)測codY基因啟動子所在的范圍。利用引物Co7(5'－TAAGAGATCTATTCGTGAAAACTGGAC－3')和 Co8(5'－CCATCTGCAGTGTCTTCACTTTCTATT－3')，以嗜熱鏈球菌KLDS 3.0503的基因組為模板擴(kuò)增該基因的啟動子。將大小為273 bp的PCR產(chǎn)物連入克隆載體pMD19－T simple后熱轉(zhuǎn)E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞后測序。

1.4 pNZ273/codY質(zhì)粒的構(gòu)建

將codY基因啟動子的PCR回收產(chǎn)物和pNZ273質(zhì)粒分別用內(nèi)切酶BglⅡ和PstⅠ雙酶切后連接，將連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)入E.coli DH5α，重組質(zhì)粒通過BglⅡ和PstⅠ雙酶切和PCR反應(yīng)進(jìn)行鑒定。將連接正確的質(zhì)粒定名為 pNZ273/codY。接著，將重組質(zhì)粒pNZ273/codY電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌NZ9000中［9］，通過5 μg/ml氯霉素篩選陽性克隆子。

1.5 嗜熱鏈球菌內(nèi)源性質(zhì)粒的提取和序列測定

嗜熱鏈球菌KLDS3.8501內(nèi)源性質(zhì)粒的提取采用天根公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒進(jìn)行，經(jīng)過以下修改:將菌體離心后重懸于含有30 mg/ml溶菌酶的STE緩沖液中，37℃溫育20 min［10］，其余操作按照說明書進(jìn)行。然后，回收其中的小質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為 p3.8501－1。分別利用 BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、SacⅠ和SalⅠ單酶酶切質(zhì)粒p3.8501－1，以分析其含有的酶切位點(diǎn)。選取其中一個(gè)酶的酶切質(zhì)粒，回收酶切后的線性片斷連入克隆載體測序。然后，根據(jù)已測部分序列設(shè)計(jì)引物對整個(gè)質(zhì)粒測序［11］。

1.6 嗜熱鏈球菌表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)質(zhì)粒p3.8501－1全基因序列信息及序列分析結(jié)果，在復(fù)制蛋白質(zhì)編碼基因的兩側(cè)設(shè)計(jì)引物Stpr－up2(5'－AGTCTCGAGGTATTATGTCTTTGAAATTG－3')和 St－pr－down2(5'－CTTGTCGACTAATTAAAAATTACGAAAAG－3')，利用PCR擴(kuò)增的方法來獲取復(fù)制子片段。PCR產(chǎn)物大小約為3 000 bp。

利用引物 Co23(5'－GTACTCGAGAAGCTTCACCG－3')和 Co24(5'－CACGTCGACCAACAATTTAGAT－3')從質(zhì)粒pNZ273/codY中擴(kuò)增出含有氯霉素抗性基因、codY啟動子和gusA基因序列的片斷。PCR產(chǎn)物大小約為2 800 bp。

將以上2個(gè)PCR產(chǎn)物回收后，分別利用SalⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，然后利用T4 DNA連接酶將2個(gè)片斷進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化入無質(zhì)粒的嗜熱鏈球菌 KLDS3.0503 中［12］，利用 5 μg/ml氯霉素篩選陽性克隆子，將陽性重組質(zhì)粒命名為pST1。

1.7 codY基因啟動子的啟動效果驗(yàn)證

1.7.1 在乳酸乳球菌NZ9000中的啟動效果驗(yàn)證

將攜帶有重組質(zhì)粒pNZ273/codY的乳酸乳球菌NZ9000轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到含有終濃度為0.5 mmol/L 5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－葡糖苷酸(X－Gluc)的 GM17 固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后檢測 gusA基因是否表達(dá)［9］。

1.7.2 在嗜熱鏈球菌KLDS3.0503中的啟動效果驗(yàn)證 將攜帶有重組質(zhì)粒pST1的嗜熱鏈球菌KLDS3.0503轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到含有終濃度為0.5 mmol/L X－Gluc的LM17固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后檢測gusA基因是否表達(dá)［9］。

1.7.3 不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)Gus酶的表達(dá)情況確定以對硝基苯－β－D－葡萄糖酸為 β－葡糖苷酸酶(Gus酶)的底物，接種乳酸乳球菌NZ9000/pNZ273/codY和嗜熱鏈球菌KLDS3.0503/pST1過夜培養(yǎng)物，接種量為2%，檢測不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)Gus酶的表達(dá)情況［9，13］。

2 結(jié)果

2.1 嗜熱鏈球菌codY基因啟動子的擴(kuò)增

以嗜熱鏈球菌KLDS 3.0503基因組為模板，擴(kuò)增出codY基因啟動子對應(yīng)的片段(圖1)，同天根的MarkerⅢ相比，大小略大于200 bp，同目的條帶大小相同(273 bp)，測序結(jié)果正確。

圖1 codY基因啟動子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR product of the codY promoter

2.2 pNZ273/codY質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ和PstⅠ雙酶切后，獲得了兩條大小分別為4 500 bp和200 bp左右的片斷。以該質(zhì)粒為模板，使用引物Co7和Co8進(jìn)行PCR反應(yīng)后也得到了大小在200 bp左右的片斷，這說明codY基因啟動子已連入啟動子探針型載體pNZ273的gusA基因前，即 pNZ273/codY質(zhì)粒構(gòu)建成功。將pNZ273/codY質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ9000中，獲得陽性克隆子。

2.3 嗜熱鏈球菌內(nèi)源性質(zhì)粒的提取和序列測定

嗜熱鏈球菌KLDS 3.8501內(nèi)源性質(zhì)粒圖譜如圖2所示，可以看出，該菌株含有多個(gè)質(zhì)粒。將其中最小的質(zhì)粒p3.8501－1回收，選擇不同的酶分別酶切該質(zhì)粒，確定該質(zhì)粒的酶切圖譜，結(jié)果如圖3所示，可以看出，該質(zhì)粒能被BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ酶切，而不能被SacⅠ和SalⅠ酶切。

圖2 嗜熱鏈球菌KLDS3.8501內(nèi)源性質(zhì)粒圖譜Fig.2 Plasmid profile of Streptococcus thermophilus KLDS3.8501

圖3 質(zhì)粒p3.8501-1酶切圖譜Fig.3 Profile of the plasmid p3.8501-1 analyzed by restriction enzyme

大量提取質(zhì)粒p3.8501－1后，選取HindⅢ酶切該質(zhì)粒，回收大小在800 bp左右的片斷，連入克隆載體測序，然后根據(jù)已測序列設(shè)計(jì)引物，對整個(gè)質(zhì)粒測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該質(zhì)粒大小為3 361 bp，與NCBI上公布的嗜熱鏈球菌LMD－9 plasmid 2(NC_008501)的序列基本相同(預(yù)測到的復(fù)制區(qū)域完全相同)，復(fù)制方式為滾環(huán)復(fù)制。

2.4 嗜熱鏈球菌表達(dá)載體的構(gòu)建

由于pNZ273的復(fù)制子是pSH71，它在嗜熱鏈球菌中不能穩(wěn)定存在，很容易丟失，因此本試驗(yàn)試圖使用嗜熱鏈球菌菌株內(nèi)穩(wěn)定遺傳的p3.8501－1質(zhì)粒的復(fù)制子來構(gòu)建表達(dá)載體。

質(zhì)粒p3.8501－1的復(fù)制子區(qū)段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后在3 000 bp左右有一條片斷出現(xiàn)，與預(yù)期片斷長度相同。從質(zhì)粒pNZ273/codY中擴(kuò)增出含有氯霉素抗性基因、codY啟動子及gusA基因的DNA片段，電泳結(jié)果符合預(yù)期大小。

將以上獲得的2個(gè)PCR產(chǎn)物通過SalⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接，將連接液電轉(zhuǎn)化入KLDS 3.0503的感受態(tài)細(xì)胞中，通過5 μg/ml氯霉素篩選陽性克隆子。重組質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ和XhoⅠ雙酶切后分別在3 000 bp和2 800 bp左右有相應(yīng)條帶出現(xiàn)，表明重組質(zhì)粒pST1構(gòu)建成功。該質(zhì)粒的物理遺傳圖譜如圖4所示。

圖4 pST1質(zhì)粒的物理遺傳圖譜Fig.4 Physical and genetic map of plasmid pST1

2.5 codY基因啟動子的啟動效果驗(yàn)證

將乳酸乳球菌NZ9000/pNZ273/codY和嗜熱鏈球菌KLDS3.0503/pST1的菌落分別轉(zhuǎn)接到含有終濃度為0.5 mmol/L X－Gluc的 GM17和 LM17固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后，NZ9000/pNZ273/codY和KLDS3.0503/pST1的菌落全部顯示藍(lán)斑，這說明codY啟動子在這2種菌內(nèi)均能啟動下游gusA基因的表達(dá)，產(chǎn)生的β－葡糖苷酸酶分解了X－Gluc的葡萄糖苷酸糖苷鍵產(chǎn)生藍(lán)色沉淀。然后，以對硝基苯－β－D－葡萄糖酸為底物，測定了2種重組菌在不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)β－葡糖苷酸酶的活性，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯?，對于由codY啟動子誘導(dǎo)β－葡糖苷酸酶表達(dá)的菌株來說，在培養(yǎng)的前2 h內(nèi)，沒有檢測到β－葡糖苷酸酶的活性;4 h后才能檢測到該酶活性的表達(dá)，此時(shí)菌株正好處于對數(shù)生長期。

圖5 2種重組菌在不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)β-葡糖苷酸酶的活性Fig.5 Activities of β-glucuronidases in the two recombinant strains cultured for different time

3 討論

研究一些基因在不同時(shí)間內(nèi)的表達(dá)情況多采用熒光定量PCR的方法，但是對于乳酸菌來說，因其是革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁不易裂解，因此RNA的提取不方便，且易降解，同時(shí)需在不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)取樣提取RNA后進(jìn)行研究，這樣既加大了勞動量也增加了試驗(yàn)成本。為了研究嗜熱鏈球菌中CodY蛋白在不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的表達(dá)量，以弄清其自身的調(diào)控機(jī)制，本試驗(yàn)選取了一個(gè)新的研究方法，借助于啟動子探針型載體pNZ273，將該蛋白的啟動子插入報(bào)告基因gusA前，通過檢測不同時(shí)間內(nèi)Gus酶的活性來間接反映CodY蛋白的表達(dá)。首先構(gòu)建了乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ273/codY。由于pNZ273的復(fù)制子是SH71，在嗜熱鏈球菌中不能穩(wěn)定復(fù)制，因此將pNZ273的復(fù)制子替換成嗜熱鏈球菌內(nèi)源性質(zhì)粒的復(fù)制子，成功構(gòu)建了嗜熱鏈球菌的表達(dá)載體pST1。通過檢測不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)乳酸乳球菌NZ9000/pNZ273/codY和嗜熱鏈球菌KLDS3.0503/pST1的Gus酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌株生長到對數(shù)生長期時(shí)gusA基因才開始表達(dá)，這說明嗜熱鏈球菌的codY基因啟動子具有自身的調(diào)控作用，使得下游基因在菌株的對數(shù)生長期才開始表達(dá)。這就克服了以往組成型啟動子的缺點(diǎn)，避免了菌株在生長初期就承受表達(dá)外源蛋白的負(fù)擔(dān)或毒性作用。并且，由于codY啟動子具有自身調(diào)控的特點(diǎn)，這就省去了外源添加物的誘導(dǎo)和一些特殊基因的限制。

試驗(yàn)中在兩種菌內(nèi)測得的β－葡糖苷酸酶的表達(dá)量都不是很高，最高值也只有 9.6 nmol/(min·mg)。這說明codY啟動子不是一種強(qiáng)啟動子，但是如果需要在乳酸菌內(nèi)表達(dá)某些功能基因，而對其表達(dá)量要求不很高時(shí)，該啟動子是一個(gè)很好的選擇。

本試驗(yàn)利用嗜熱鏈球菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白CodY的啟動子成功構(gòu)建了兩個(gè)乳酸菌表達(dá)載體pNZ273/codY和pST1。在乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌中，該啟動子都能啟動下游gusA基因的表達(dá)，并且當(dāng)菌株生長到對數(shù)生長期時(shí)，才檢測到β－葡糖苷酸酶的活性，這說明codY啟動子憑借自身的調(diào)控機(jī)制可以起到誘導(dǎo)型啟動子的作用。

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