譚冬梅，鄧慧蘭，胡淑芬，郭秀儀，黃福喜

（廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科1，腫瘤科2，廣東 廣州 511400）

結(jié)直腸癌(CRC)是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一。大多數(shù)有臨床癥狀的CRC患者確診時(shí)已是疾病的中晚期，這是治愈率低、致死率高的一個(gè)主要原因。所以疾病的早期診斷顯得尤為重要。近年，國(guó)內(nèi)外眾多研究團(tuán)隊(duì)都在尋找一種簡(jiǎn)單而有效的早期診斷方法。而運(yùn)用分子生物學(xué)研究腫瘤已成為當(dāng)今潮流，尋找有價(jià)值的分子標(biāo)志物，可早期發(fā)現(xiàn)某些腫瘤。本實(shí)驗(yàn)研究CD166在結(jié)直腸癌患者外周血CD3+T細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討其作為早期篩查結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物的可能性，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 一般材料 選取2011年1月至2013年2月在廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院住院和門診的結(jié)直腸癌病例167例作為觀察組，所有患者未經(jīng)放療和化療，所有病例均經(jīng)病理切片確診，全部病例按VICC腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分型及TNM分期，收集這些患者的外周血液標(biāo)本。同時(shí)選取134例排除有結(jié)直腸癌家族史、便血的健康體檢者外周血液標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 儀器試劑 儀器使用BD流式細(xì)胞儀FACSCANTOⅡ(BD公司)，BD公司配套試劑：MOUSE LG1 PE；MOUSE LG1 APC；MOUSE Anti Human CD166PE(克隆號(hào)：3A6)；CD3APC(克隆號(hào)：SK7)；質(zhì)控品：Rainbow Fluorescent Particles(BD公司)。

1.2.2 操作方法 兩組均按流式細(xì)胞術(shù)常規(guī)操作進(jìn)行：(1)靜脈采血2 ml，EDTA-K抗凝管抗凝；(2)開(kāi)機(jī)進(jìn)行Set up，并做質(zhì)控；(3)兩組標(biāo)本均設(shè)各自同型對(duì)照，將標(biāo)本搖勻，吸取50 μl全血于流式專用試管中，同型對(duì)照管加入 MOUSE LG1 PE 5 μl，MOUSE LG1-APC 5 μl；測(cè)定管加入 CD166-PE 5 μl，CD3-APC 5 μl；混勻后，避光保存15 min；(4)加入溶血素 2 ml，混勻后，避光10 min；(5)離心5 min，棄上清液；(5)加入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)2 ml，離心5 min，棄上清液；(7)加入250 μl PBS，混勻，上機(jī)；(8)同型對(duì)照管調(diào)節(jié)電壓，用CD3-APC/SSC設(shè)門，檢測(cè)CD3陽(yáng)性細(xì)胞群中CD166細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本組資料為偏態(tài)分布，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)得出方差不齊，采用兩獨(dú)立樣本的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P＜0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

收集直腸癌患者及健康人群中10 000個(gè)CD3陽(yáng)性細(xì)胞設(shè)門見(jiàn)圖1，測(cè)定健康人群中10 000個(gè)CD3陽(yáng)性細(xì)胞的CD166PE-A的平均熒光強(qiáng)度見(jiàn)圖2，測(cè)定病例組中10 000個(gè)CD3陽(yáng)性細(xì)胞的CD166PE-A的平均熒光強(qiáng)度見(jiàn)圖3。再統(tǒng)計(jì)分析所有健康人群組及直腸癌病例組的CD166PE-A平均熒光強(qiáng)度見(jiàn)表1，健康人群組CD3+T細(xì)胞上CD166PE-A的平均熒光強(qiáng)度為(125.69±21)道數(shù)，結(jié)直腸癌觀察組外周血中CD3+T細(xì)胞上CD166PE-A的平均熒光強(qiáng)度為(171.31±42)道數(shù)，兩組比較，Z值為4.519，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 CD3APC-A的熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，側(cè)角光(SSC)為縱坐標(biāo)，P2為1 000個(gè)CD3陽(yáng)性細(xì)胞設(shè)門

圖2 橫坐標(biāo)為CD166PE-A的平均熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞分布頻數(shù)

圖3 橫坐標(biāo)為CD166PE-A的平均熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞分布頻數(shù)

表1 CD166在結(jié)直腸癌患者及健康人群中的表達(dá)和統(tǒng)計(jì)分析(±s)

表1 CD166在結(jié)直腸癌患者及健康人群中的表達(dá)和統(tǒng)計(jì)分析(±s)

組別 例數(shù)CD166平均熒光強(qiáng)度(道數(shù))Z值P值結(jié)直腸癌患者健康人群167 134 171.31±42 125.69±214.519＜0.01

3 討論

CD3+T是成熟T淋巴細(xì)胞的共同分化抗原，抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[1]。近年來(lái)研究表明T淋巴細(xì)胞在腫瘤抗原的識(shí)別、呈遞等方面都擔(dān)負(fù)著極其重要的作用。CD3+T細(xì)胞作為腫瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞的重要成分之一，已在結(jié)直腸癌的研究中被證實(shí)與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)[2-4]。有研究表明大腸癌組織中存在腫瘤干細(xì)胞(TSC)，而CDl66被認(rèn)為是TSC的標(biāo)記物[3]，常表達(dá)在活化的T淋巴細(xì)胞上，作為T淋巴細(xì)胞表面的細(xì)胞其中之一的表型，其表達(dá)水平與腫瘤的關(guān)系已成為目前研究的熱點(diǎn)[5-6]。故本課題是試圖通過(guò)檢測(cè)外周血CD3+細(xì)胞中CD166的表達(dá)水平來(lái)反映直腸癌患者的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而探索外周血CD3+細(xì)胞中CD166的表達(dá)水平作為直腸癌早期診斷指標(biāo)的可能性。

從本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，初診結(jié)直腸癌患者組血液中CD3+T細(xì)胞上CD166平均熒光強(qiáng)度總體均數(shù)高于健康對(duì)照組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)直腸癌患者的外周血中CD3+T細(xì)胞上CD166的平均水平的增高可能與宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)，特異性反應(yīng)在的CD3+T淋巴細(xì)胞上[7]。有研究提示CD166在結(jié)腸正常組織中不表達(dá)，而在腺瘤到腺癌的過(guò)程表達(dá)量明顯增加，從正常組織到瘤，再到癌的過(guò)程中，CD166的表達(dá)量呈持續(xù)上升，證明其參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生[8]。伴隨著CD166表達(dá)水平的增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)明顯升高，證明CD166可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[9]。CD166在結(jié)腸癌細(xì)胞的胞膜和胞漿中均有表達(dá)，且它們的表達(dá)存在中度相關(guān)，推測(cè)它們?cè)诖龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲活動(dòng)中可能存在某些共同通路或因果關(guān)系，從而推斷CD166在結(jié)腸癌細(xì)胞的活動(dòng)中可能起著促進(jìn)作用[10]。當(dāng)CD3+T細(xì)胞隨血流進(jìn)入腫瘤間質(zhì)時(shí)，由于癌變細(xì)胞表面或胞膜內(nèi)的CD166水平有明顯變化，CD166作為一種腫瘤相關(guān)抗原通過(guò)CD3+T淋巴細(xì)胞的識(shí)別、呈遞，隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移，外周血中CD3+T細(xì)胞上CD166的平均水平也隨之增高。

我們可以通過(guò)研究不同分期的結(jié)直腸癌患者的外周血中CD3+T細(xì)胞上CD166的平均水平，從而預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌患者沒(méi)有癥狀或是癥狀輕微時(shí)，體內(nèi)的分子標(biāo)記已開(kāi)始有變化時(shí)，外周血中CD3+T細(xì)胞上CD166的平均水平，為結(jié)直腸癌進(jìn)行篩查、早期診斷提供證據(jù)，此舉對(duì)結(jié)直腸癌的診治產(chǎn)生重要影響。有研究表明結(jié)直腸癌組織中CD166的表達(dá)與結(jié)腸癌的預(yù)后呈負(fù)性相關(guān)，低分化癌中有著更明顯的表達(dá)，是判斷預(yù)后的前兆因子[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明抗CD166的單鏈抗體可抑制裸鼠結(jié)腸腫瘤的生長(zhǎng)，據(jù)此可推測(cè)抗CD166抗體在人結(jié)腸癌的靶向治療中的應(yīng)用有著廣泛的前景[12-13]。故本課題可進(jìn)一步研究外周血中CD3+T細(xì)胞上CD166水平與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系，以及靶向治療的療效監(jiān)測(cè)研究。

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