彭方毅，楊海艷，姜海蓉，徐建建，伍 娟，周 歡，袁兵占

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054;2.重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院，重慶 402260)

3－硝基酪氨酸(3NT)是機(jī)體在氮氧化物存在的條件下氧化損傷的一種特殊形式，非常穩(wěn)定［1］，常常在病理狀態(tài)下伴隨活性氧和活性氮的增加而產(chǎn)生，是活性氮(RNS)對(duì)蛋白酪氨酸殘基氧化修飾的產(chǎn)物，也是體內(nèi)RNS形成的重要生物標(biāo)志物［2－3］。目前，3NT的檢測方法主要有高效液相色譜法［4－6］及氣相與質(zhì)譜聯(lián)用法等，但這些方法需要對(duì)樣品進(jìn)行處理，較為復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且影響檢測的準(zhǔn)確性［7－8］，重復(fù)性差，靈敏度低，缺乏選擇性，不適用于現(xiàn)場大量樣本的快速檢測。因此，人們迫切需要一種簡便、快速、廉價(jià)及適合多樣品同時(shí)檢測的技術(shù)［9］。將3NT與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原，制備針對(duì)3NT的抗體，采用免疫學(xué)方法，如ELISA、Western blot、免疫組化和免疫沉淀等，為超微量檢測3NT開辟了新的途徑。該技術(shù)特異性強(qiáng)，靈敏度高，簡單快速，且成本低廉，樣品不需要前處理，可同時(shí)測定大量的實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組樣品，被廣泛應(yīng)用于生物、化工、醫(yī)學(xué)、環(huán)境、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［10］。本研究采用戊二醛法，將3NT與卵白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，再用紫外掃描法和聚丙烯酰胺電泳法對(duì)其進(jìn)行鑒定，用BCA法測定二者結(jié)合物的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)，并測得結(jié)合物的偶聯(lián)率，免疫小鼠，獲得效價(jià)高且敏感的抗3NT抗體，為建立特異性的檢測3NT的酶聯(lián)免疫吸附法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

3NT合成于北京中科亞光生物科技有限公司;戊二醛購自SIGMA-ALORICH公司;卵白蛋白(OVA)購自Thermo公司;GelCode Blue Stain Reagent染色液、0.2% 溴酚藍(lán)、10%TEMED、低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購自BIO－RAD;BCA試劑盒購自pierce公司;其余試劑為分析純。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)6周齡雌性BALB/C小鼠;紫外分光光度計(jì)、SDSPAGE電泳儀、酶標(biāo)儀由北歐生物科技(北京)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫抗原的制備(戊二醛法)

① 取 600 μL OVA(5 mg/mL)與 1.5 mL 3NT(2mg/mL)溶液混勻，于4℃冷卻。② 加21 μL 25%戊二醛，于4℃下反應(yīng)2 h。③ 室溫下加入事先配制好的 0.4 M 乙醇胺(0.5M NaCO3)106 μL，2 h后終止反應(yīng)。④將反應(yīng)液在1×PBS緩沖液中透析，至少進(jìn)行5次換液。取出3NT與OVA的結(jié)合物溶液，于－20℃冰箱冷藏保存。

1.2.2 免疫抗原的鑒定

①紫外分光光度法:采用透析用PBS調(diào)零，同時(shí)設(shè)有OVA、3NT對(duì)照，對(duì)經(jīng)透析后的3NT與OVA結(jié)合物在190～350 nm的波長下進(jìn)行紫外掃描，通過比較載體蛋白在交聯(lián)前后的圖譜變化進(jìn)行初步分析，判斷3NT是否與載體蛋白OVA偶聯(lián)。②聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS－PA GE電泳)［11－12］:其中分離膠的體積分?jǐn)?shù)為 12% ，濃縮膠的體積分?jǐn)?shù)為5%。③ 偶聯(lián)率的測定:卵白蛋白含量測定用BCA法，具體步驟見文獻(xiàn)［13］，用酶標(biāo)儀測定吸光度。測出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再對(duì)結(jié)合物與OVA在波長280 nm處吸光度的差值進(jìn)行計(jì)算，其中3NT在PBS中的摩爾消光系數(shù)ε=A(280)/CL=8 100 cm－1M－1。

1.2.3 多抗血清(pAb)的制備

用上述3NT與OVA的偶聯(lián)物免疫6周齡雌性BALB/C小鼠6只，免疫劑量每只30 μg，每只0.2 mL，皮下注射4～6點(diǎn)。首免時(shí)，用生理鹽水定容免疫原，與等量FCA混合，充分乳化;加強(qiáng)免疫時(shí)，將FCA改FIA混合，乳化，共免疫4次，每2周免疫1次，并采血，分離血清，于 －20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 抗血清的鑒定

采用上述血清進(jìn)行效價(jià)測定和競爭抑制實(shí)驗(yàn)?？寡逍r(jià)測定采用間接ELISA法。首先，用PBS-BTE將包被抗原稀釋到10 ng/mL，加到96孔酶標(biāo)板(Streptavidin coated MTP)上，每孔100 uL，20℃溫育，并震板1 h，洗滌5次后拍干(下同);用PBS-BT將抗血清梯度濃度稀釋加到板孔中，每孔100 uL，20℃溫育1 h，洗滌;用 PBS-BT 1∶10000稀釋二抗(羊抗鼠)，每孔 100 uL，20℃ 溫育1 h，洗滌;再加入TMB底物溶液，每孔50 uL，避光溫育15 min;最后每孔加入100 uL 2mol/L的硫酸溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上測定450處吸光值。其中空白對(duì)照(BC)為 PBS-BT溶液，陰性對(duì)照(NC)為小鼠免疫前所采的陰性血清。陽性孔判定:待測孔OD450值大于等于NC OD450值的2.1倍(P/N≥2.1)，陽性孔的血清最大稀釋度即為抗血清的效價(jià)［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 通過顏色判斷偶聯(lián)是否成功

3－硝基酪氨酸是有顏色的物質(zhì)。主要是物質(zhì)當(dāng)中的硝基為發(fā)色團(tuán)，能加深色原體的顏色，且本身呈黃色;而原載體蛋白OVA中無硝基的存在，為無色液體。本實(shí)驗(yàn)在完成透析前后反應(yīng)體系均呈淺黃色，說明偶聯(lián)成功。

2.2 紫外掃描

載體蛋白(OVA)、3－硝基酪氨酸和二者結(jié)合物的紫外掃描結(jié)果見圖1。

OVA在波長280 nm處有最大吸收峰，3－硝基酪氨酸在277 nm波長處有最大吸收峰，而兩者結(jié)合物的最大吸收峰在270 nm，明顯不同于載體蛋白與半抗原的吸收曲線。在抗原合成過程中，經(jīng)過透析后已經(jīng)基本上把反應(yīng)中殘留的小分子物質(zhì)從蛋白溶液中除去，而紫外圖譜顯示經(jīng)透析過后的蛋白特征吸收峰明顯發(fā)生紅移，說明載體蛋白上偶聯(lián)上了3NT，證明人工抗原合成成功。

圖1 卵白蛋白、三硝基酪氨酸及二者結(jié)合物的紫外光譜

2.3 電泳

圖2顯示，OVA條帶在43KD左右，而3NT與OVA結(jié)合物的條帶明顯比43KD大，且成一區(qū)域性條帶，進(jìn)一步說明偶聯(lián)成功。

圖2 3NT與OVA結(jié)合物的SDS-PAGE電泳圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

卵白蛋白含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得 A=0.16，B=0.001 52。結(jié)合物的兩復(fù)孔值分別為OD1=1.437，OD2=1.454。代入公式C=(OD－A)/B得到稀釋過的結(jié)合物溶液的蛋白質(zhì)濃度C=0.847 mg/mL，而結(jié)合物溶液的蛋白質(zhì)濃度為0.847 ×2=1.69 mg/mL，為計(jì)算3NT的偶聯(lián)率提供了數(shù)據(jù)。

由紫外掃描圖譜知，A280(結(jié)合物)=1.5，A280(OVA)=0.645，而 OVA 濃度 =0.847 mg/mL，OVA摩爾分子量為43 000。代入公式

可得3－硝基酪氨酸的偶聯(lián)率為5.4。

2.5 抗血清的效價(jià)測定

由間接ELISA法測定6只小鼠血清，測得其中2只(348#與358#)抗血清的效價(jià)分別為1∶80 000與1∶27 000，結(jié)果見表1，說明被免疫的這2只小鼠產(chǎn)生了抗體。

表1 間接ELISA測小鼠血清效價(jià)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用戊二醛法將大分子量的載體蛋白OVA與小分子的半抗原3－硝基酪氨酸連接，得到完全抗原3NT-OVA結(jié)合物，紫外光譜掃描結(jié)果及SDS-PAGE電泳表明3－硝基酪氨酸偶聯(lián)成功。計(jì)算得到3－硝基酪氨酸與OVA的偶聯(lián)率為5.4，為進(jìn)一步建立酶聯(lián)免疫吸附法測定人體內(nèi)3－硝基酪氨酸含量提供了合適的免疫原。

用紫外分光光度法測定的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)數(shù)目一般比它的實(shí)際值低，可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所測3－硝基酪氨酸的偶聯(lián)數(shù)目是在假定其在波長280 nm的摩爾消光系數(shù)和3NT-OVA結(jié)合物在同一波長的摩爾消光系數(shù)相同的前提下計(jì)算出來。且在用紫外分光光度法掃描時(shí)，最初發(fā)現(xiàn)蛋白與結(jié)合物在20 μg/mL的濃度下掃描時(shí)，二者波峰均不明顯，甚至未出現(xiàn)波峰，產(chǎn)生原因可能是濃度太低，紫外無法掃描，增大濃度即可改變此現(xiàn)象。

綜上所述，本研究成功合成了3NT人工抗原，免疫BALB/C小鼠后制備出高效價(jià)、敏感的pAb，為抗3NT單克隆抗體(mAb)的進(jìn)一步研制、免疫學(xué)分析方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

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