蔡家利，戶國(guó)達(dá)，孫加燕，尹忠寶，張存亮，陳文毫

病毒性傳染病是困擾我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展最突出的問題之一，每年因病毒感染引起豬死亡和生長(zhǎng)障礙而造成的經(jīng)濟(jì)損失無法估計(jì)。干擾素(interferon，IFN)是一種可抑制病毒復(fù)制的細(xì)胞因子，是由病毒或其他IFN誘導(dǎo)劑作用于易感細(xì)胞后產(chǎn)生的一種小分子糖類蛋白，具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等功能［1］。據(jù)報(bào)道在各種類型的IFN 中，IFN-α 的抗病毒作用最強(qiáng)［2，3］。

目前，市售的豬α-干擾素由豬白細(xì)胞和原核表達(dá)系統(tǒng)獲得，僅豬白細(xì)胞IFN獲得農(nóng)業(yè)部新獸藥的批文［4］。白細(xì)胞干擾素來源極其有限，大大制約了其應(yīng)用。原核表達(dá)系統(tǒng)，尤其是大腸桿菌表達(dá)雖然表達(dá)效率高，但表達(dá)出的重組豬α-干擾素多是以不溶的無功能的包涵體形式存在，必須通過復(fù)雜的變性復(fù)性過程才能獲得有功能的蛋白，并且成功率較低。近年來，很多專家學(xué)者將研究重心轉(zhuǎn)移到酵母菌［5］、桿狀病毒、腺病毒［6］、轉(zhuǎn)基因植物［7］上，并取得了重大成果，但是始終存在一些技術(shù)瓶頸，如豬α-干擾素的表達(dá)水平偏低、高密度發(fā)酵工藝復(fù)雜等，還無法實(shí)現(xiàn)豬IFN-α的規(guī)?；a(chǎn)。據(jù)報(bào)道，豬IFN-α無需翻譯后加工修飾，采用新的可溶表達(dá)策略即可實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)，大大加快了豬α-干擾素規(guī)模化生產(chǎn)進(jìn)程。

本研究采用新的可溶性策略，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a-poIFNα，通過與Trx融合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了豬α-干擾素的可溶性表達(dá)，只需一步純化，即可獲得純度較高的豬α-干擾素重組產(chǎn)物。這對(duì)豬α-干擾素作為新的生物藥物的進(jìn)一步開發(fā)利用具有極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體與菌株

pET32a+、大腸桿菌 DH5α和 BL21菌株，由重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司饋贈(zèng)。

1.1.2 工具酶及其他材料

DNA抽提試劑盒、蛋白Marker購(gòu)自天根公司;TaqDNA聚合酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I、T4連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司;Ni-NTA親和樹脂來源于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 抗體

抗豬α-干擾素鼠源單抗;羊抗鼠IgG-HRP。

1.2 PCR擴(kuò)增IFN-α

提取新鮮豬肝臟組織基因組DNA，根據(jù)Gen-Bank中豬IFN-α基因序列(登錄號(hào)為M28623.1)設(shè)計(jì)引物。上游引物為5’-GGAATTCTGTGACCTGCCTCAG-3’;下游引物 5’-CCGCTCGAGTCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’。在上、下游引物中分別引入 EcoR I、Xho I酶切位點(diǎn)(下劃線表示)。PCR反應(yīng)體系按照TaqDNA聚合酶附帶的說明書制定。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，然后經(jīng)歷94℃ 45 s、61℃ 45 s、72℃ 1 min 共35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物鑒定后回收純化，-20℃保存。

1.3 重組質(zhì)粒pET32a-IFN-α的構(gòu)建

分別回收EcoR I、Xho I酶雙酶切后的PCR產(chǎn)物和pET32a質(zhì)粒，按體積比7∶1，16℃連接過夜。將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化新鮮制備的DH5α感受細(xì)胞，使用含終濃度為100 μg/mL Amp的LB進(jìn)行篩選。過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落PCR鑒定，對(duì)陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，然后送TaKaRa公司測(cè)序，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 工程菌的構(gòu)建

將測(cè)序?yàn)殛栃缘闹亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)，用含Amp的LB平板進(jìn)行篩選。過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落PCR鑒定，對(duì)陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.5 rpoIFN-α的誘導(dǎo)表達(dá)

挑選篩選出的陽性BL21(DE3)單克隆菌株，接種于5mL含終濃度為100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。將菌液按體積比1∶100接種到20 mL含 Amp的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，22℃培養(yǎng)8 h后收集菌液，5 000 r/min離心取沉淀。按照每1 g菌加入10 mL PBS的比例，使其重懸，然后超聲破菌。破菌液離心后，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析［8］。

1.6 rpoIFN-α的純化

22℃誘導(dǎo)表達(dá)3L菌液，離心收集菌體。按體積比1∶3～1∶10的比例加入裂解液，超聲破碎后離心收集破菌上清。用0.45 μm的水系過濾器過濾一次，隨流動(dòng)相進(jìn)入已平衡好的Ni柱。用平衡Buffer平衡柱子，收集穿透液，再用 20、50、100、200、400 mmol/L咪唑梯度洗脫，每次洗脫體積為40 mL，用SDS-PAGE分析純化效果。

1.7 Western-blot鑒定

取純化后的表達(dá)產(chǎn)物10 μL，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。在100 V條件下電轉(zhuǎn)2 h，將rpoIFN-α從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移到NC膜上。用5%的脫脂奶粉(用PBST配置)37℃封閉2 h，再用PBST洗膜3次。加入抗豬α-干擾素鼠源單抗(1∶2000稀釋)，37℃孵育1 h，再用PBST洗膜3次。加入羊抗鼠IgG-HRP(1∶4000稀釋)，37℃孵育1 h。再用PBST洗膜3次。加入DAB顯色液暗區(qū)反應(yīng)5～10 min，用水進(jìn)行漂洗。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET32a-IFN-α的鑒定

2.1.1 PCR鑒定

菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在501bp附近位置有明顯的條帶(見圖1)，與預(yù)期相符。

圖1 重組pET32a+-PoIFNα質(zhì)粒菌落PCR鑒定結(jié)果

2.1.2 雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒pET32a+-PoIFNα經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后可見線性質(zhì)粒的條帶及501bp的目的基因片段，與PoIFNα基因的大小相吻合(見圖2)。

圖2 重組pET32a+-PoIFNα質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.1.3 測(cè)序結(jié)果與分析

經(jīng)比對(duì)，克隆得到的基因序列與Genebank上登錄號(hào)為AY776246、M28623的poIFNα同源性分別為99%、97%(見圖3)，初步認(rèn)定克隆得到的基因是PoIFNα基因，可以用來制備PoIFNα。

圖3 DNA序列比對(duì)

2.2 PoIFNα的表達(dá)

經(jīng)過對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間的研究，確定出可溶性表達(dá)最佳誘導(dǎo)條件為22℃，10 h，0.5 mmol/L IPTG。用最佳條件誘導(dǎo)后，破菌上清與沉淀經(jīng)SDS-PAGE分析，poIFNα多以可溶性表達(dá)的形式出現(xiàn)在破菌上清中(見圖4)。

圖4 重組蛋白可溶性分析

2.3 PoIFNα的純化結(jié)果

梯度洗脫，收集到的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析后，濃度為20 mmol/L時(shí)可以洗去幾乎所有的雜蛋白，在50 mmol/L時(shí)進(jìn)一步純化，在100 mmol/L時(shí)洗脫即可得到純度很高的PoIFNα，為大量產(chǎn)物純化奠定了基礎(chǔ)(見圖5)。

圖5 PoIFNα純化電泳圖

純化后的PoIFNα經(jīng)Western blot檢測(cè)在膜上有特異性的條帶出現(xiàn)(見圖6)，進(jìn)一步證實(shí)產(chǎn)物為PoIFNα。

圖6 Western blot結(jié)果

3 討論

大腸桿菌表達(dá)真核蛋白時(shí)，多形成不溶性的、無功能的包涵體。因此，如何實(shí)現(xiàn)真核蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)是擺在我們面前亟待解決的問題。

在眾多學(xué)者的不斷探索創(chuàng)新中，人們已經(jīng)積累了一些實(shí)現(xiàn)蛋白可溶性表達(dá)的經(jīng)驗(yàn):①選擇合適的宿主菌［9］，例如選擇蛋白酶缺失的菌株;②共表達(dá)一種或多種分子伴侶或折疊酶［10-11］;③ 選擇適宜的載體，實(shí)現(xiàn)融合表達(dá)［12］;④ 通過定點(diǎn)突變，改變蛋白結(jié)構(gòu)［13］;⑤ 優(yōu)化培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)條件［14-15］。由于蛋白種類繁多，理化性質(zhì)各異，目前很難找到一種通用的方法。對(duì)于某一蛋白可溶性表達(dá)策略的選取，只能在研究中摸索、積累經(jīng)驗(yàn)，并同時(shí)關(guān)注相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)嘗試使用前人在豬α-干擾素原核表達(dá)中未曾使用的質(zhì)粒pET32a+，實(shí)現(xiàn)了PoIFNα的可溶性表達(dá)，并取得了成功。pET32a+含有TrxA基因，可以與下游多克隆位點(diǎn)插入的目的基因融合表達(dá)，所編碼的硫氧還原蛋白可大大提高目的蛋白的溶解度和活性，并且載體上帶有His標(biāo)簽，通過鎳柱親和層析一步純化即可得到融合蛋白。這為實(shí)現(xiàn)其他真核蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)提供了重要參考。

下一步工作的重心是PoIFNα活性的測(cè)定。將采用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定PoIFNα在動(dòng)物細(xì)胞上對(duì)動(dòng)物病毒的抑制作用。

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