張雖栓，王 霞

（河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院食品與化工系，河南平頂山467000）

高分子量裂褶菌多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化組合

張雖栓，王 霞

（河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院食品與化工系，河南平頂山467000）

目的:優(yōu)選高分子量裂褶菌多糖的培養(yǎng)基的最佳組合.方法:對(duì)提高高分子量裂褶菌多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)基組合進(jìn)行了單因素和正交試驗(yàn)研究，以確定最佳實(shí)驗(yàn)條件.結(jié)果:KH2P04濃度為0.3%、3-吲哚丁酸的濃度為0.04%；發(fā)酵培養(yǎng)條件的選擇是：接種量為13%(V/V).結(jié)論:高分子量裂褶菌在優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)條件下得到高分子量裂褶菌多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)1.768%.

裂褶多糖；分離純化；培養(yǎng)；正交試驗(yàn)

裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.簡(jiǎn)稱SPG)是一種珍貴的藥食兼用真菌，裂褶菌胞外多糖是菌體經(jīng)深層發(fā)酵產(chǎn)生的中性胞外多糖，由單一的β-(1-3)-D-葡聚糖組成的螺旋結(jié)構(gòu)和良好的水溶性，在調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗輻射等方面有顯著的療效[1]，經(jīng)硫酸酸化后具有抗HIV活性，能抑制HIV-1產(chǎn)生的細(xì)胞裂變[2].其分子量從十幾萬到上百萬不等.然而，SPG的結(jié)構(gòu)和分子量不同嚴(yán)重影響其生物學(xué)活性及應(yīng)用.文獻(xiàn)報(bào)道，裂褶胞外多糖的相對(duì)分子質(zhì)量多在80-100kDa[3-6]之間，而分子量在100kDa以上的裂褶菌多糖具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用最為廣泛，需求量最大[7].我們?cè)谖⑸锇l(fā)酵技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化培養(yǎng)基的組合，改進(jìn)培養(yǎng)工藝，提高裂褶菌多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為裂褶菌菌的產(chǎn)業(yè)化栽培和進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用提供支持.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裂褶菌種：昆明科技開發(fā)有限公司提供.

1.2 設(shè)備與儀器

恒溫?fù)u床：中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；

HZQ-F280全溫度振蕩培養(yǎng)箱：太倉市華美生化儀器廠；

真空干燥箱2K-82A型：上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；

pH計(jì)320-S型：METTLERTOLED；

UV-2102PC紫外——可見分光光度計(jì)：德國(guó)Bruker公司；

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

裂褶菌種采用PDA固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基是由馬鈴薯180g/L,KH2PO42.8g/L,葡萄糖18g/L，Mg-SO4.7H2O1.4g/L,蛋白胨4.9g/L,pH=5.8，瓊脂20 g/L組成.配好的PDA培養(yǎng)基裝在試管中，于140℃時(shí)滅菌20Min，冷卻，將菌種接種到試管斜面培養(yǎng)基上，靜置、活化4d，活化后的菌種接入裝有50ml培養(yǎng)基的錐形瓶中，28℃下培養(yǎng)1.5d，得液體菌種；接著接種到固體培養(yǎng)基27℃下，培養(yǎng),7d，菌絲長(zhǎng)滿后備用[8,9].

1.3.2 裂褶菌多糖百分含量測(cè)定方法

裂褶菌多糖百分含量的測(cè)定方法：采用常用的苯酚-硫酸比色法測(cè)定[10].

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

不同培養(yǎng)基的選擇對(duì)高分子量裂褶菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有直接的影響，設(shè)定了碳源、氮源、KH2PO4、3-吲哚乙酸（IBA）四個(gè)因素對(duì)高分子量裂褶菌多糖培養(yǎng)基的選擇進(jìn)行了試驗(yàn).

2.1.1 最佳碳源作為培養(yǎng)基對(duì)高分子量裂褶菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

實(shí)驗(yàn)選取了1.葡萄糖（10%）、2.蔗糖（10%）、3.麥芽糖（10%）、4.葡萄糖（10%）+羧甲基纖維素（1%）、5.玉米淀粉、6.果糖（10%）作為待選碳源[11-12].發(fā)酵完成后，測(cè)定多糖含量；結(jié)果如圖1表明，葡萄糖（10%）+羧甲基纖維素（1%）是該菌種發(fā)酵生產(chǎn)的最佳碳源，多糖產(chǎn)量可達(dá)1.8%.

圖1 不同碳源對(duì)裂褶菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖2 葡萄糖含量對(duì)裂褶菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

最佳碳源濃度的大小對(duì)菌體的生長(zhǎng)速度、代謝、產(chǎn)物的合成以及氧氣的流通量多少都會(huì)造成影響.若碳源用量過少，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成都會(huì)停止，反之，則會(huì)出現(xiàn)抑制生長(zhǎng)的現(xiàn)象.如圖2所示，在葡萄糖濃度偏低或偏高時(shí)都會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖的合成形成抑制，使合成速率減慢，導(dǎo)致質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低.因此，碳源濃度的大小對(duì)微生物發(fā)酵生長(zhǎng)具有相當(dāng)重要的作用.經(jīng)單因素分析，該實(shí)驗(yàn)選用12%的葡萄糖做為最佳碳源.

圖2 葡萄糖含量對(duì)裂褶菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.3 KH2PO4的濃度對(duì)高分子量裂褶菌多糖多糖含量的影響

從圖3可知，KH2P04的濃度對(duì)裂褶菌多糖產(chǎn)量的影響表現(xiàn)出最適濃度效應(yīng).隨著KH2P04濃度的增加，裂褶菌多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也在不斷的提高，當(dāng)KH2P04濃度達(dá)一定值后繼續(xù)升高時(shí)，裂褶菌多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則降低，因此，KH2P04最適添加量為0.3%.

圖3 KH2P04的含量對(duì)裂褶菌多糖產(chǎn)量的影響

2.1.4 3-吲哚乙酸的濃度對(duì)高分子量裂褶菌多糖多糖含量的影響

3-吲哚丁酸是一種植物細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)劑，它能夠刺激植物細(xì)胞快速生長(zhǎng)，分別以3-吲哚丁酸添加量為0.02%、0.05%、0.1%和0.15%在培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果見圖4.

由圖4可知，開始，隨IBA含量的不斷提高，裂褶菌多糖的產(chǎn)量也隨之增加，但當(dāng)IBA濃度過高時(shí)又降低了裂褶菌多糖的產(chǎn)量，故IBA含量對(duì)裂褶菌多糖促進(jìn)作用的最佳濃度分別為0.04%.

圖4 IBA的含量對(duì)裂褶菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化

表1培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn)因素及水平表

表1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

由表1正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出,實(shí)驗(yàn)得到裂褶菌多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到1.768%,最佳水平組合是A3B2C3D2,根據(jù)表中極差R的分析，各個(gè)因素對(duì)裂褶菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響順序是A>D>C>B,因此，最佳組合為A3B2C3D2.即加人葡萄糖的含量達(dá)12%，酵母粉含量達(dá)0.8%，KH2P04的含量達(dá)0.3%，3-吲哚丁酸的含量為0.04%.

3 裂褶菌多糖的純化與分子量的測(cè)定

3.1 裂褶菌多糖的純化

經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體→粉碎→熱水浸泡→乙醇多次沉淀→洗滌→熱水溶解→過濾，濃縮→粗多糖→活性炭褪色→Sevag法脫蛋白→裂褶菌多搪純品.

3.2 裂褶菌多糖分子量的測(cè)定

裂褶多糖分子量的測(cè)定：采用高效凝膠色譜法，利用標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線，再根據(jù)裂褶菌多糖的洗脫曲線與標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線做比較，查表可知，所得多糖的分子量約為510kDa.

4 結(jié)論

(1)經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)確定了裂褶菌生長(zhǎng)最適宜的培養(yǎng)基成分為:以0.8%酵母粉和0.2%NH4NO3為混合氮源，3-吲哚丁酸的濃度為0.04%，KH2P04濃度為0.3%，以12%的葡萄糖為最佳碳源時(shí)，裂褶多糖的提取率最高.

(2)用高效凝膠色譜分析確定樣品單糖組分為具有良好水溶性的β-(1-3)-D葡聚糖，分子量約為510kDa.研究可知：裂褶菌多糖在調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤和抗輻射活性均與多糖的結(jié)構(gòu)和相對(duì)分子質(zhì)量的大小有關(guān)，較大分子量的裂褶多糖才具有更加顯著地抗腫瘤和輻射活性，本實(shí)驗(yàn)為后期研究高分子量裂褶多糖的培養(yǎng)和在藥用領(lǐng)域的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ).

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S646

A

1673-260X（2013）12-0060-03