王維揚(yáng) 黃懷宇

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是常見(jiàn)于中老年人神經(jīng)系統(tǒng)變性疾?。?］。左旋多巴(L-dopar)替代治療是公認(rèn)的最常用、最有效、最基礎(chǔ)的治療藥物［2］，但其不良反應(yīng)不容忽視，中醫(yī)藥治療PD 是我國(guó)臨床醫(yī)學(xué)的一大特色。本研究旨在探討天麻素治療PD 大鼠的實(shí)驗(yàn)性研究，為天麻素用于PD 患者臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 60 只健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(體質(zhì)量180 ～200 g，2 ～3 月齡，南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。6-羥多巴胺(6-OHDA)、阿樸嗎啡(APO)、抗壞血酸購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。小鼠抗酪氨酸羥化酶(TH)單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Chemicon 公司。熒光標(biāo)記羊抗小鼠IgG 二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。天麻素注射液由上?，F(xiàn)代哈森有限公司提供，左旋多巴購(gòu)買(mǎi)于上海羅氏制藥公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備與分組:2%戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠顱平位固定于江彎I 型C 腦立體定向儀上，調(diào)上門(mén)齒鉤平面，比耳間線平面低2 ～4 mm，使前囟與后囟保持在同一平面，定位于右側(cè)中腦腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)區(qū)，破壞黑質(zhì)紋狀體束［3］。向定位點(diǎn)緩慢注入4 μl 6-OHDA，骨臘封閉顱骨孔并縫合頭皮，術(shù)后大鼠置于25 ℃溫室中直至清醒后置籠喂養(yǎng)。造模后第14 天腹腔注射APO 0.5 mg/kg 誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為，采用鐘式測(cè)轉(zhuǎn)儀測(cè)量旋轉(zhuǎn)次數(shù)，注射15 min后開(kāi)始記錄，共記錄30 min，平均轉(zhuǎn)速＞7 r/min 視為成功PD 大鼠模型［4］。選取造模成功的PD 模型大鼠40 只，隨機(jī)分為4 組，每組10 只。對(duì)照組生理鹽水5 ml/kg，腹腔注射;左旋多巴組7.8 mg/kg，皮下注射;天麻素組0.2 g/kg，腹腔注射;聯(lián)合處理組天麻素0.2 g/kg，腹腔注射加用左旋多巴7.8 mg/kg，皮下注射，以上用藥每天1 次，持續(xù)給藥14 d，觀察行為學(xué)后處死，取大鼠腦標(biāo)本。

1.2.2 病理標(biāo)本的留取:用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，打開(kāi)大鼠胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈灌注生理鹽水300 ml，繼之用4%多聚甲醛450 ml 灌注，之后斷頭取腦。將大鼠腦組織置于4%多聚甲醛，4 ℃放置4 h，再移入30%蔗糖緩沖液中24 h，待組織塊沉底，固定后的中腦黑質(zhì)部位用冰凍切片機(jī)切片，片厚15 μm。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè):用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗滌腦片5 min×3 次，將切片放到8%羊血清中，4 ℃過(guò)夜保存，棄去8% 羊血清，加入抗體工作液(1 ∶600 TH)4 ℃，3 d 后將鼠腦加入熒光標(biāo)記二抗工作液中(TH 染色加入羊抗鼠二抗)4 ℃，2 d 后用50%甘油封片，用熒光顯微鏡成像系統(tǒng)拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 在200 倍顯微鏡下計(jì)數(shù)各組標(biāo)本兩側(cè)黑質(zhì)致密部的TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，同一鼠腦同側(cè)三張累加計(jì)數(shù)值。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用成組設(shè)計(jì)的單因素方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗(yàn)，P ＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 天麻素對(duì)PD 大鼠行為的影響 治療前各組PD大鼠每分鐘旋轉(zhuǎn)圈數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。治療后3 個(gè)治療組與對(duì)照組比較PD 大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);天麻素組與左旋多巴組PD 大鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);聯(lián)合處理組較左旋多巴組旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 注射APO 后大鼠每分鐘旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的比較(±s，圈，n=10)

表1 注射APO 后大鼠每分鐘旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的比較(±s，圈，n=10)

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與左旋多巴組比較，△P ＜0.05

組別治療前治療后11.52 ±2.2410.78 ±2.37左旋多巴組12.03 ±2.818.30 ±1.71*天麻素組10.49 ±2.637.82 ±1.54*聯(lián)合處理組11.71 ±3.076.21 ±1.02對(duì)照組＊△

2.2 天麻素對(duì)PD 大鼠VTA 區(qū)TH 陽(yáng)性神經(jīng)元的影響 對(duì)照組左側(cè)VTA 區(qū)的TH 陽(yáng)性神經(jīng)元未見(jiàn)丟失，對(duì)照組右側(cè)VTA 區(qū)的TH 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量比左側(cè)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);天麻素組及聯(lián)合處理組與對(duì)照組右側(cè)比較TH 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);聯(lián)合處理組與左旋多巴組比較TH 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與天麻素組比較，聯(lián)合處理組TH 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。天麻素及左旋多巴對(duì)PD 大鼠VTA 區(qū)TH 陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)量的影響。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦組織VTA 區(qū)TH

3 討論

在大鼠的行為學(xué)評(píng)價(jià)方面，APO 誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)是目前認(rèn)為比較客觀的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)［5］。多巴胺D2受體主要存在于DA 能神經(jīng)元的突觸后膜，當(dāng)PD 動(dòng)物模型損毀側(cè)DA 能神經(jīng)元減少時(shí)，在受體調(diào)節(jié)機(jī)制作用下，損毀同側(cè)的D2受體相應(yīng)上調(diào)，引起去神經(jīng)超敏現(xiàn)象。APO 是一種D2受體激動(dòng)劑，當(dāng)損毀側(cè)黑質(zhì)-紋狀體區(qū)DA 能神經(jīng)元破壞超過(guò)70%時(shí)，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)動(dòng)作遲緩、僵硬少動(dòng)等癥狀，而當(dāng)出現(xiàn)APO 誘導(dǎo)性旋轉(zhuǎn)時(shí)，則表明毀損側(cè)破壞的DA 能神經(jīng)元數(shù)量已經(jīng)＞90%［6］。本研究顯示6-OHDA 大鼠PD 模型毀損術(shù)后2 周，APO 誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)平均速度達(dá)11.44 r/min。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示天麻素和左旋多巴均能顯著降低大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，而兩者聯(lián)合用藥能使作用加強(qiáng)。

DA 的缺乏是PD 發(fā)病的發(fā)生基礎(chǔ)，DA 合成的限速酶TH 在PD 的發(fā)病中起重要作用。大量研究證實(shí)，PD 動(dòng)物模型及PD 病人體內(nèi)TH 基因、酶蛋白含量及分布等存在廣泛的異常改變［7］。本研究顯示，6-OHDA 大鼠PD 模型各組中腦VTA 區(qū)TH 陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)數(shù)量顯著減少。說(shuō)明存在DA 能神經(jīng)元大量脫失，經(jīng)黑質(zhì)-紋狀體通路投射到紋狀體的DA 能神經(jīng)遞質(zhì)顯著減少，從而導(dǎo)致大鼠DA 和乙酰膽堿(Ach)系統(tǒng)失衡而產(chǎn)生行為學(xué)障礙，而予以天麻素等治療后，各治療組VTA 區(qū)TH 陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量明顯增加，與對(duì)照組比較，各治療組黑質(zhì)區(qū)TH 神經(jīng)元的變性、退化及壞死程度較輕，天麻素組及聯(lián)合處理組較左旋多巴組改善更明顯。表明中藥天麻素能增加PD 大鼠VTA 區(qū)TH 的表達(dá)，減少DA 神經(jīng)元損害的數(shù)量及程度，從而保護(hù)DA 神經(jīng)元，減少PD 大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。TH 染色結(jié)果，進(jìn)一步形態(tài)學(xué)方面證實(shí)天麻素可有效保護(hù)神經(jīng)組織免受6-OHDA 引起的神經(jīng)毒性損傷所造成的損害，從而為PD 的防治提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

PD 最主要的病變是黑質(zhì)變性，由于黑質(zhì)變性導(dǎo)致其致密部不能合成DA 輸送至紋狀體，使紋狀體抑制性的DA 與興奮性Ach 的功能失衡而發(fā)病。所以在臨床上，一旦明確診斷PD 后，病人應(yīng)長(zhǎng)期服藥［8］。目前，無(wú)論是使用抗膽堿能藥物，還是DA 替代療法，長(zhǎng)期治療后療效減退，癥狀波動(dòng)，并有神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)。本研究贊同黃懷宇等［9］的觀點(diǎn)，采用中藥如天麻、丹參等制劑聯(lián)合治療，不僅能減少美多巴等藥物的用量，療效持久，不良反應(yīng)小，而且天麻、丹參等中藥制劑能夠補(bǔ)腎益氣，抗自由基，可以減輕PD 的病理?yè)p害，減輕PD 的癥狀。選擇中醫(yī)藥聯(lián)合治療PD 不失為臨床上的一個(gè)有益嘗試，值得進(jìn)一步研究。

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