汪曉艷 趙雁林 逄宇 王玉峰 萬康林 劉潔 劉英 沈靜 杜昌廷 張舜

·論 著 ·

重慶市結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的基因分型及相關(guān)耐藥性分析

汪曉艷 趙雁林 逄宇 王玉峰 萬康林 劉潔 劉英 沈靜 杜昌廷 張舜

目的 對重慶市結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進行基因分型，研究不同基因型在重慶的流行情況，并分析基因型與耐藥表型的關(guān)系。方法 收集2011年1—12月重慶市結(jié)核病防治所分離的113株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，采用比例法進行藥物敏感性檢測；應(yīng)用間隔區(qū)寡核苷酸分型（Spoligotyping）和PCR方法對113株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進行基因分型。結(jié)果 在113株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，可分為北京家族和非北京家族，分別占77株（68.1%，77/113）和36株（31.9%，36/113）；北京家族菌株中現(xiàn)代型為48株（62.3%，48/77），古代型為29株（37.7%，29/77）；非北京家族菌株中，T1型高達13株（36.1%，13/36），發(fā)現(xiàn)9種新基因型。北京家族菌株耐藥率為24.7%（19/77），非北京家族菌株耐藥率為38.9%（14/36），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.40，P＞0.05）?，F(xiàn)代型北京家族菌株耐藥率為27.1%（13/48），古代型北京家族菌株耐藥率為20.7%（6/29），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 0.39，P＞0.05）。結(jié)論 重慶地區(qū)結(jié)核分枝桿菌具有明顯的基因多態(tài)性，其主要流行基因型為北京家族，其中北京家族中主要為現(xiàn)代型；北京家族菌株、非北京家族菌株均與耐藥性無明顯相關(guān)性。

分枝桿菌，結(jié)核； 基因型； 抗藥性，細菌； 基因分型技術(shù)； 重慶市

據(jù)估計，世界人口有1/3感染過結(jié)核分枝桿菌。我國的結(jié)核病患者例數(shù)位居世界第二位，并且80%的結(jié)核病患者來自農(nóng)村地區(qū)。重慶市是西部結(jié)核病疫情較重的地區(qū)，據(jù)統(tǒng)計，2008年登記的12萬例疑似結(jié)核病患者中，農(nóng)村邊遠地區(qū)患者占70%以上。結(jié)核病不僅影響民眾的身體健康，同時也給社會帶來嚴重的經(jīng)濟負擔［1］。

結(jié)核分枝桿菌基因分型有助于更好地理解結(jié)核病的流行規(guī)律。通過分型研究證實結(jié)核分枝桿菌具有明顯的基因多態(tài)性，并且不同的基因家族具有獨特的分子特征、地區(qū)性分布和致病性［2］。因此，對結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進行分子分型鑒定不僅成為結(jié)核病分子流行病學(xué)研究的基礎(chǔ)，而且成為目前結(jié)核病研究的熱點之一。間隔區(qū)寡核苷酸分型（Spoligotyping）自20世紀90年代由Kamerbeek等設(shè)計用于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因分型以來，由于其具有操作簡便、快速，結(jié)果易數(shù)字處理，可重復(fù)性高，分型效果穩(wěn)定，且具有較豐富的多態(tài)性，無需菌株培養(yǎng)等優(yōu)點，在世界范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用［3］。

筆者對2011年1—12月從重慶市結(jié)核病患者分離培養(yǎng)到的113株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進行基因分型研究，以了解重慶地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因型和特征；了解北京家族在重慶的流行狀況；分析不同基因型，特別是北京家族與抗結(jié)核藥物耐藥性的關(guān)系。

材料和方法

一、標本來源及資料

113株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株來源于2011 年1—12月重慶市結(jié)核病防治所分離的113例涂片陽性痰標本，其中男83例，女30例，年齡范圍14～82歲，平均年齡（61±14.57）歲，均為具有重慶戶籍的結(jié)核病患者。對菌株進行培養(yǎng)鑒定和藥物敏感性檢測。參照菌株采用標準菌株H37Rv，由中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實驗室提供。

二、藥物敏感性試驗

藥物敏感性試驗采用比例法。培養(yǎng)基內(nèi)藥物的終濃度分別為：異煙肼0.2μg/ml、利福平40μg/ml、乙胺丁醇2μg/ml、鏈霉素4μg/ml、氧氟沙星2μg/ml。對以上檢測的任何一種藥物耐藥的菌株為耐藥株。具體方法見文獻［4］。

三、DNA提取

收集經(jīng)羅氏（L-J）培養(yǎng)基（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）培養(yǎng)、生長良好菌體，取適量，80℃孵育30 min滅活，離心收集菌體，用400μl TE緩沖液懸菌，于沸水中煮沸30 min；離心半徑10 cm，12 000 r/min，離心3 min，取上清即為DNA模板，—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四、分型方法

1.Spoligotyping分型：根據(jù)Kamerbeek等［5］建立的Spoligotyping標準化方法對113株結(jié)核分枝桿菌進行分型。通過引物DRa和DRb擴增結(jié)核分枝桿菌DR區(qū)。DRa：5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′，5′端進行生物素標記；DRb：5′-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′。PCR反應(yīng)條件：96℃3 min；96℃1 min，55℃1 min，72℃30 s，35個循環(huán)；延伸6 min。同時擴增結(jié)核分枝桿菌H37Rv和卡介苗（中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實驗室提供）作為對照。將PCR產(chǎn)物與結(jié)合有43個間隔區(qū)寡核苷酸探針的Biodyne C膜（美國Pall公司）進行雜交。最后，通過鏈霉素親和素-過氧化物酶聯(lián)接體（streptavidin-peroxidase conjugate，華美生物工程公司）進行酶孵育及CDP-star（華美生物工程公司）檢測，X線曝光獲得結(jié)果。

2.NTF分型：通過引物（引物為NTF-L：5′-CCAGATATCGGGTGTGTCGAC-3′；NTF-R，5′-TGCCGTTGTCGAAATCTAAACCC-3′。對Spoligotyping鑒定出的北京家族菌株在NTF區(qū)進行擴增，PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃1 min，62℃1 min，72℃1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

五、結(jié)果判定

1.Spoligotyping結(jié)果分析：對Spoligotyping 43個間隔區(qū)雜交結(jié)果指紋圖譜進行分析。其間隔區(qū)的存在用二進制表示，Spoligotyping結(jié)果通過國際數(shù)據(jù)庫MIRU-VNTRplus（http：//www.miruvntrplus.org）［6］進行比對，主要是與世界各地已知的結(jié)核分枝桿菌基因型分別比對，從而確定菌株基因家族和（或）基因型。用BioNumerics（version 5.0）軟件分析：將Spoligotyping結(jié)果進行軟件聚類，聚類主要根據(jù)平均連鎖聚類法進行，結(jié)果判定由圖可知特征相同或相近的菌株被分為同一型。

2.NTF結(jié)果分析：通過電泳結(jié)果，分析IS6110插入情況；古典型表現(xiàn)為302 bp，現(xiàn)代型表現(xiàn)為1500 bp。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對表型和基因型數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，基因型檢出率差異比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用logistic單因素回歸分析，對不同年齡、性別、基因型對不同菌株產(chǎn)生耐藥的情況進行統(tǒng)計分析。運用Pearson卡方檢驗，對北京家族現(xiàn)代型和古代型分離株產(chǎn)生耐藥情況的差異進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、菌株不同基因型的組成

菌株呈現(xiàn)多個基因型，如圖1所示，可分為2個基因群，即北京家族（Beijing family）［或稱北京基因型（Beijing genotype）］和非北京家族（non-Beijing family），分別為77株（68.1%）和36株（31.9%），共有27種基因型，其中19株為獨立類型，其余94株分為8簇，成簇率為83.2%（94/113）。非北京家族菌株表現(xiàn)為高度的基因多態(tài)性，可分為20個基因型，15株為獨立類型。

圖1 結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping基因分型聚類分析圖

二、Spoligotyping不同分型的分布

如圖2所示，113株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株以北京家族為主要基因型。非北京家族以 T家族為主要基因型，其中T1基因型為13株（36.1%，13/ 36）；T2基因型為3株（8.3%，3/36）；T3基因型為1株（2.8%，1/36）；T5基因型為3株（8.3%，3/36）；U基因型為2株（5.6%，2/36）；H3基因型為3株（8.3%，3/36）；LAM3&convergent基因型為1株（2.8%，1/36）；LAM4基因型為1株（2.8%，1/36）。另外，發(fā)現(xiàn)9株（25.0%，9/36）結(jié)核分枝桿菌菌株表現(xiàn)的9種基因型在國際數(shù)據(jù)庫中未檢索到，為新的基因型。

圖2 113株結(jié)核分枝桿菌的主要Spoligotyping家族和次要家族的流行分布

三、重慶市113株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株與耐藥性相關(guān)分析

在本研究中，113株臨床分離株均獲得基因分型結(jié)果，并獲得完整的藥敏實驗結(jié)果。應(yīng)用logistic單因素回歸分析，對不同年齡、性別、基因型對不同菌株產(chǎn)生耐藥的情況進行分析，結(jié)果顯示不同年齡、性別、基因型對菌株產(chǎn)生耐藥的情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

四、北京家族結(jié)核分枝桿菌與耐藥性相關(guān)分析

如表2所示，本研究將77株北京家族菌株分為現(xiàn)代型和古代型，分別為48株（62.3%，48/77）和29株（37.7%，29/77）。其中任意耐藥現(xiàn)代型菌株為13株（27.1%，13/48），任意耐藥古代型菌株為6株（20.7%，6/29）。經(jīng)Pearson卡方分析，北京家族不同亞型的分離株發(fā)生耐藥的情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）。

表1 不用因素對抗結(jié)核藥物的耐藥情況

表2 北京家族古代基因型和現(xiàn)代基因型對抗結(jié)核藥物的耐藥情況

討 論

北京家族是中國結(jié)核分枝桿菌的主要基因型。據(jù)報道，中國北方地區(qū)和南方地區(qū)北京家族表現(xiàn)為“北多南少”的特征：北方地區(qū)的北京家族達到76.5%，而南方地區(qū)的北京家族只有53.2%［7］。重慶位于中國的西南方，是結(jié)核病疫情高發(fā)區(qū)。此次研究中，筆者的研究結(jié)果顯示：重慶北京家族占全部菌株的68.1%（77/113），為重慶市主要流行基因型，與報道基本相符。通過NTF分型，將北京家族分為古代型與現(xiàn)代型。文獻報道，現(xiàn)代型結(jié)核分枝桿菌引起包括中國、俄羅斯、南非在內(nèi)的世界范圍的流行［8-9］；而古代型在美國引起了小范圍的暴發(fā)［10］，在HIV/Mtb雙重感染患者中也檢測到古代型北京家族結(jié)核分枝桿菌［11］。本研究結(jié)果顯示，在77株北京家族菌株中古代型為29株（37.7%，29/77），現(xiàn)代型為48株（62.3%，48/77）。說明現(xiàn)代型北京家族結(jié)核分枝桿菌在重慶市北京家族結(jié)核分枝桿菌中占優(yōu)勢地位，所以加強流行病學(xué)檢測和生物學(xué)特性研究是十分必要的。非北京家族占31.9%（36/113），其表現(xiàn)為高度的基因多態(tài)性，以T家族為主，其中T1基因型檢出率為36.1%（13/36）。文獻報道，T1、T2主要流行于非洲和中、南美洲地區(qū)［12］，因此，T1在重慶的高檢出率可能與該地區(qū)炎熱、潮濕的氣候因素有關(guān)，人口流動也可能是原因之一，另外，本研究發(fā)現(xiàn)了9種新基因型，將在后期工作中展開關(guān)于這部分新基因型的分子進化的研究。本研究結(jié)果基本探明了重慶市結(jié)核分枝桿菌基因型的特點，為重慶市結(jié)核病病原學(xué)和結(jié)核病控制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

另外，結(jié)核病的耐藥問題是目前結(jié)核病防治的重要研究課題，由于耐多藥北京家族菌株多次引起暴發(fā)性流行，使得北京家族菌株與耐藥之間的關(guān)系成為了研究的熱點［13］，但研究結(jié)果不盡相同。有些文獻報道，北京家族菌株耐藥率高于非北京家族，如越南胡志明市、愛沙尼亞、美國紐約等地區(qū)［14］。也有文獻報道，北京家族菌株與非北京家族菌株耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，如印度尼西亞、阿塞拜疆、哥倫比亞等地區(qū)，而香港地區(qū)北京家族菌株的耐異煙肼菌株比率甚至低于非北京家族菌株［15-16］。筆者的研究結(jié)果顯示：77株北京家族耐藥率為24.7% （19/77），36株非北京家族耐藥率為38.9%（14/36），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.40，P＞0.05）。說明不支持北京家族菌株更易產(chǎn)生耐藥的推斷，即不認為結(jié)核分枝桿菌北京家族與耐藥性之間存在相關(guān)性?，F(xiàn)代型北京家族耐藥率為27.1%（13/48）；古代型北京家族耐藥率為20.7%（6/29），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.39，P＞0.05）。筆者推測現(xiàn)代型、古代型北京家族與耐藥性之間不存在相關(guān)性。采用寡核苷酸方法分辨出的基因型與耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，一方面也可能是由于樣本量較?。涣硪环矫婀押塑账岱直婺芰τ邢?，筆者將在后續(xù)實驗中擴大樣本量，采用多種其他基因分型方法補充完整。

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Genotyping and drug resistance analysis of M.tuberculosis clinical isolates in Chongqing

WANG Xiao-yan*，ZHAO Yan-lin，PANG Yu，WANG Yu-feng，WAN Kang-lin，LIUJie，LIU Ying，SHENJing，DUChang-ting，ZHANG Shun.*Reference Laboratory，Chongqing Institution of Tuberculosis Control and Prevention，Chongqing 400050，China

ZHANG Shun，Email：ZS52077@sina.com

Objective To study the prevalence of different genotypes of M.tuberculosis in Chongqing and analyze the relationships between genotype and drug-resistant phenotype.Methods One hundred and thirteen M. tuberculosis clinical isolates were collected in Chongqing from January to December in 2011，performed drug susceptibility testing by the proportion method，analyzed the genotypes by Spoligotyping and PCR method，and then made gene glustering analysis.Results One hundred and thirteen clinical strains were divided into 2 gene clusters，namely Beijing family（68.1%，77/113）and non-Beijing family（31.9%，36/113）.Of 77 Beijing family strains，48 （62.3%）strains were belong to modern type，29（37.7%）were the ancient type.Of 36 strains with non-Beijing family，13（36.1%）strains were T1 type，and found 9 new genotypes.The drug-resistant rate of Beijing family strains was 24.7%（19/77），and of non-Beijing family strains was 38.9%（14/36），in which there was no significant differences（χ2=2.40，P＞0.05）.The drug-resistant rate of modern type strains in Beijing family was 27.1% （13/48），and of the ancient type strains was 20.7%（6/29），in which there was no significant differences（χ2= 0.39，P＞0.05）.Conclusion There was obvious gene polymorphism in M.tuberculosis isolates in Chongqing. Beijing family was the main epidemic strains，in which the modern type was predominant.There was no significant correlation between genotype and drug resistance.

Mycobacterium tuberculosis； Genotype； Drug resistance，bacterial； Genotyping techniques；Chongqing city

2013-07-22）

（本文編輯：郭萌）

400050重慶市結(jié)核病防治所參比實驗室（汪曉艷、劉潔、劉英、沈靜、杜昌廷、張舜）；中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心 國家結(jié)核病參比實驗室（趙雁林、逄宇、王玉峰）；中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所（萬康林）

張舜，Email：ZS52077@sina.com