王婷 趙雁林 劉家云 逄宇 周楊 趙冰 趙鋼

·論 著 ·

結(jié)核性腦膜炎臨床分離株基因型和耐藥表型的特征分析

王婷 趙雁林 劉家云 逄宇 周楊 趙冰 趙鋼

目的 了解導(dǎo)致結(jié)核性腦膜炎（TBM）的致病菌在基因型和耐藥表型方面的特征。方法 利用間隔區(qū)寡核苷酸分型法（Spoligotyping）和數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）分型法對(duì)25株TBM臨床分離菌株進(jìn)行基因分型；采用MGIT（mycobacteria growth indicator tube）960液體和比例法固體藥敏試驗(yàn)分別對(duì)所選15種藥物：異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、吡嗪酰胺（PZA）、鏈霉素（S）、卡那霉素（Km）、阿米卡星（Am）、卷曲霉素（Cm）、莫西沙星（Mfx）、氧氟沙星（Ofx）、左氧氟沙星（Lfx）、對(duì)氨基水楊酸（PAS）、乙硫異煙胺（Eto）、丙硫異煙胺（Pto）、環(huán)絲氨酸（Cs）進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 Spoligotyping分型法確定了在25株TBM臨床分離株中有20株為北京基因型，占80.0%（20/25），2株為T1基因型，另外3株分別為T2型、LAM6型及未知型；VNTR有2株成一簇，基因型一樣；25株TBM分離株中耐多藥結(jié)核性腦膜炎（MDR-TBM）占12.0%（3/25），廣泛耐藥結(jié)核性腦膜炎（XDR-TBM）占4.0%（1/25），耐氟喹諾酮類的菌株占8.0%（2/25），都屬于北京基因型；任意耐藥的菌株占48.0% （12/25），其中83.3%（10/12）為北京基因型；全敏感者占52.0%（13/25），其中76.9%（10/13）為北京基因型。結(jié)論 北京基因型在耐藥TBM中所占比例很高，尤其是 MDR-TBM，較其他基因型更易引起腦脊液生化的改變；耐氟喹諾酮類的菌株所占比例最少，提示臨床上氟喹諾酮類藥物對(duì)治療TBM會(huì)有很好的療效。

結(jié)核，腦膜； 分枝桿菌，結(jié)核； 基因型； 抗藥性，細(xì)菌； 寡核苷酸分型； 小衛(wèi)星重復(fù)

表1 25個(gè)VNTR位點(diǎn)、引物序列，及其在H37Rv中的重復(fù)次數(shù)

Mtb基因分型是識(shí)別結(jié)核病人群間傳播的重要方法，可用于更準(zhǔn)確地識(shí)別結(jié)核病的暴發(fā)、流行及其傳播模式。近年來(lái)，基于Mtb散在分布重復(fù)單位（mycobacterial interpersed repetitive units，MIRUs）的多位點(diǎn)可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列分析（mutiple loci VNTR analysis，MLVA）分型方法在國(guó)內(nèi)外 Mtb基因分型研究中越來(lái)越受到關(guān)注。它是以PCR為基礎(chǔ)，利用基因組中特定位點(diǎn)可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR），即不同菌株間拷貝數(shù)差異鑒定菌株，從而進(jìn)行基因分型。本實(shí)驗(yàn)選取了文獻(xiàn)報(bào)道［5］的25個(gè)分辨力較高的MIRUs的位點(diǎn)，對(duì)25 株TBM臨床分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠上通過(guò)電泳確定擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度。再根據(jù)各位點(diǎn)不同重復(fù)單位拷貝數(shù)來(lái)區(qū)別并分型。此法操作簡(jiǎn)單，對(duì)基因型別的分辨能力高于IS6110限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度的多態(tài)性法（IS6110 restriction fragment length po1ymorphism，IS6110-RFLP）和Spoligotyping，且試驗(yàn)成本較低，適合在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)的中低收入國(guó)家和地區(qū)應(yīng)用［6］。傳統(tǒng)的 Mtb分型方法是描述IS6110限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度的多態(tài)性，并被認(rèn)為是識(shí)別 Mtb基因型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但耗時(shí)，并需要用特殊軟件分析，現(xiàn)使用較少［7］；在我國(guó)流行的Mtb中北京基因型是一個(gè)重要的種類，具有特異分子標(biāo)志RD105基因缺失區(qū)，表現(xiàn)為1～34個(gè)雜交信號(hào)缺失。基于直接重復(fù)區(qū)（DR）缺失的間隔區(qū)寡核苷酸分型（spacer oligonucleotide typing，Spoligotyping），具有敏感度高、重復(fù)性好、特異度強(qiáng)等特性，主要用于鑒定 Mtb家族的北京型和非北京型［8］。使用MLVA和Spoligotyping定義Mtb基因型，并有效區(qū)別北京基因型中各種亞型，可以更好地了解TBM臨床分離株基因型的特點(diǎn)［9］。

鑒于此，本研究利用Spoligotyping、VNTR分型、比例法固體藥敏和液體藥敏對(duì)TBM的臨床分離株在基因型和耐藥性方面的特征作了初步分析，并嘗試與肺結(jié)核的臨床分離株各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，以了解兩者之間有無(wú)差異。

材料和方法

一、材料和試劑

1.菌株來(lái)源：陜西省西安市第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院2010年7月至2011年6月收集了500例確診TBM并住院患者的腦脊液標(biāo)本，經(jīng)BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性者有25例，并經(jīng)PCR、GeneXpert鑒定是Mtb。這25例患者包括男8例，女17例，中位年齡26歲，年齡范圍3～82歲，15～60歲占68.0%（17/25）；28.0%（7/25）有結(jié)核病接觸史，40.0%（10/25）有肺結(jié)核病史；68.0%（17/25）經(jīng)一線藥物、16.0%（4/25）經(jīng)氟喹諾酮類藥物治療過(guò)，20.0%（5/25）的患者死亡，72.0% （18/25）的患者肺部有空洞，44.0%（11/25）有高血壓或糖尿病等并發(fā)癥。H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株由國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室提供，作為對(duì)照株。

2.診斷標(biāo)準(zhǔn)：500例患者根據(jù)2009年國(guó)際TBM臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為TBM［9］，這些患者必須符合以下3個(gè)診斷標(biāo)準(zhǔn)中的任意一項(xiàng)：（1）腦脊液或組織中鏡檢查到抗酸桿菌；（2）分離培養(yǎng)出 Mtb；（3）商業(yè)化核酸擴(kuò)增檢測(cè)顯示陽(yáng)性。

3.試劑和儀器：所用試劑有2×Taq PCR Master Mix（天根生化科技有限公司）、BestaTM瓊脂糖（賽百盛基因技術(shù)有限公司）、DNA Ladder Marker （TaKaRa公司）、凝膠成像儀（FOTO DYNE公司）、Spoligotyping試劑盒，Miniblotter MN45（荷蘭Isogen Bioscience公司）、鏈霉親和素（Sigma公司）、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)（enhanced chemiluminescence，ECL）（美國(guó)Amersham Bioscience公司）、全自動(dòng)BACTEC MGITTM960TB系統(tǒng)、MGIT（mycobacteria growth indicator tube）960液體培養(yǎng)基、MGIT生長(zhǎng)添加劑（美國(guó)BD公司）。L-J固體培養(yǎng)基依據(jù)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)流程》［10］，由國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室制備。

用平板菌落計(jì)數(shù)方法，將樣品液稀釋106～107倍到每個(gè)平板生長(zhǎng)30～300個(gè)菌落為計(jì)數(shù)的合適稀釋度，涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，將涂布樣品的MRS固體培養(yǎng)基于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天后計(jì)數(shù)[17]。

二、檢測(cè)方法

1.DNA的制備：取一接種環(huán)經(jīng)L-J固體培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3周后，將生長(zhǎng)形態(tài)良好的菌體，溶于400μl TE緩沖液（p H值為8.0）中，80℃、30 min水浴滅活，渦漩振蕩混勻，沸水浴煮沸30 min，12 000 r/min，離心半徑10 cm，離心2 min，取上清備用，-20℃保存。

2.引物設(shè)計(jì)與合成：25個(gè)VNTR位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)見表1，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

3.PCR反應(yīng)體系和條件：VNTR分型采用20.0μl反應(yīng)體系，其中含上、下游引物（10μmol/L）各1.0μl，2×Taq PCR Master Mix 10.0μl，雙蒸水6.0μl，DNA模板2.0μl。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，因每條引物不同，因此退火溫度從58℃到62℃不等，退火時(shí)間為30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)之后72℃再延伸7 min。Spoligotyping采用25μl反應(yīng)體系，其中引物DRa （5′-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′）和DRb（5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′）分別為1.0μl，2×TaqPCR Master Mix為12.5μl，DNA模板2.0μl，雙蒸水8.5μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為96℃預(yù)變性3 min，96℃變性60 s，55℃退火60 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后72℃再延伸5 min。

4.抗結(jié)核藥物：所選15種藥物分別為：異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、吡嗪酰胺（PZA）、鏈霉素（S）、卡那霉素（Km）、阿米卡星（Am）、卷曲霉素（Cm）、莫西沙星（Mfx）、氧氟沙星（Ofx）、左氧氟沙星（Lfx）、對(duì)氨基水楊酸（PAS）、乙硫異煙胺（Eto）、丙硫異煙胺（Pto）、環(huán)絲氨酸（Cs），均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（St.Louis，MO，USA）。INH、EMB、PZA、Km、Am、Cm、Mfx、PAS、Cs、S溶于雙蒸水；RFP、Eto、Pto溶于DMSO有機(jī)溶劑中；Lfx、Ofx溶于NaOH（0.1 mol/L）中。所有藥物在-20℃～-4℃存放。

5.含藥培養(yǎng)基藥物的終濃度：根據(jù)2008年WHO最新指南［11］，MGIT960液體藥敏試驗(yàn)選擇14種抗結(jié)核藥物，即：INH（0.1μg/ml）、RFP（1.0 μg/ml）、EMB（5.0μg/ml）、PZA（100.0μg/ml）、S （1.0μg/ml）、Km（2.5μg/ml）、Am（1.0μg/ml）、Cm（2.5μg/ml）、Mfx（0.5μg/ml，2.0μg/ml）、Ofx （2.0μg/ml）、Lfx（1.5μg/ml）、PAS（4.0μg/ml）、Eto（5.0μg/ml）、Pto（2.5μg/ml）；固體藥敏試驗(yàn)選擇12種抗結(jié)核藥物，即：INH（0.2μg/ml）、RFP （40.0μg/ml）、EMB（2.0μg/ml）、S（4.0μg/ml）、Km（30.0μg/ml）、Am（30.0μg/ml）、Cm（40.0μg/ml）、Ofx（4.0μg/ml）、Lfx（4.0μg/ml）、PAS（1.0μg/ml）、Pto（40.0μg/ml）、Cs（30.0μg/ml）。

6.比例法固體藥敏試驗(yàn)：取L-J固體培養(yǎng)基2～3周后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落，分別在含藥培養(yǎng)基上接種0.01 ml稀釋菌液，菌液用生理鹽水將一個(gè)麥?zhǔn)蠞舛龋?07CFU/ml菌液）分別稀釋10-2和10-4倍。同時(shí)將不加菌液的L-J固體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，放入37℃溫箱中孵育4周后觀察生長(zhǎng)情況并計(jì)算菌落百分率。根據(jù)我國(guó)實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)耐藥結(jié)果進(jìn)行判定：耐藥百分率=（含藥培養(yǎng)基的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù)）×100%。耐藥百分率＜1%為敏感，≥1%為耐藥［12］。

7.液體MGIT960藥敏試驗(yàn)：嚴(yán)格地為每個(gè)MGIT960培養(yǎng)管添加800μl MGIT生長(zhǎng)添加劑。取L-J固體培養(yǎng)基2～3周后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落，分別在已加藥的MGIT培養(yǎng)管中加入500μl稀釋菌液，菌液用生理鹽水將0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞舛认♂?倍，空白對(duì)照稀釋100倍（因PZA所用培養(yǎng)管是酸性的，與其他培養(yǎng)管不同。PZA的空白對(duì)照稀釋10倍），置入MGIT960儀器中37℃培養(yǎng)。孵育至儀器報(bào)陽(yáng)，最多培養(yǎng)6周，如未能生長(zhǎng)，儀器將標(biāo)記為陰性。

8.結(jié)果檢測(cè)：VNTR實(shí)驗(yàn)中取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在2%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像儀下觀察條帶并拍照儲(chǔ)存。Spoligotyping試驗(yàn)中將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與結(jié)合有43個(gè)間隔區(qū)寡核苷酸探針的Biodyne C膜進(jìn)行雜交。最后，通過(guò)鏈霉素親和素-過(guò)氧化物酶連接體（streptavidin-peroxidase conjugate）酶孵育及CDP-star檢測(cè)，X線曝光獲取結(jié)果。

9.結(jié)果分析：（1）VNTR結(jié)果采用Gel-Pro analyzer 3.1軟件對(duì)凝膠進(jìn)行數(shù)字化處理，確定產(chǎn)物大小，據(jù)此計(jì)算每個(gè)VNTR位點(diǎn)重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)，并形成一組編碼。Spoligotyping結(jié)果為經(jīng)二進(jìn)制及八進(jìn)制數(shù)轉(zhuǎn)換后形成一組編碼，再用BioNumerics（Version 5.0）數(shù)據(jù)庫(kù)軟件對(duì)兩種分型實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，將實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行分型處理，揭示菌株間的相互關(guān)系。根據(jù)VNTR基因分型結(jié)果，設(shè)計(jì)調(diào)查表，收集成簇菌株的患者資料，用以追蹤同一簇患者間的相互傳播途徑，并分析其與耐藥結(jié)果的相關(guān)性。（2）根據(jù)各位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)計(jì)算位點(diǎn)的分辨率：本實(shí)驗(yàn)采用計(jì)算Hunter-Gaston分辨率指數(shù)（Hunter-Gaston diversity index，HGDI）來(lái)分析各位點(diǎn)的分辨率和合并分辨率，數(shù)值在0～1之間，即實(shí)驗(yàn)總體中的2個(gè)無(wú)關(guān)樣本能夠分到不同型別中的能力［13］，數(shù)值越大，分辨率越大。計(jì)算公式為

公式中N為所有菌株數(shù)，S為分型的型別數(shù)，nj表示在j型別中的菌株數(shù)［14］。（3）計(jì)算菌株成簇率：實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全相同的菌株定義為一簇，成簇率為成簇菌株占總試驗(yàn)菌株的百分率。

10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn)，以分析北京基因型菌株耐藥率和非北京型菌株的耐藥率，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

11.質(zhì)量控制：質(zhì)控均以標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和陰性對(duì)照進(jìn)行。H37Rv的Spoligotyping結(jié)果表現(xiàn)為20、21、33～36的間隔區(qū)雜交呈陰性，其他間隔區(qū)雜交均為陽(yáng)性，說(shuō)明質(zhì)控合格，若不一致，說(shuō)明不合格。對(duì)于不合理的質(zhì)控結(jié)果，采取重新檢測(cè)質(zhì)控樣品重新進(jìn)行試驗(yàn)。

結(jié) 果

一、Spoligotyping基因分型結(jié)果

從圖1中可以看出TBM臨床分離株被聚為7類，其中以典型北京基因型（1～34間隔區(qū)缺失）為主，占80.0%（20/25）。23、26為T1型，15為T2型，8為未知型（表2）。

二、北京基因型菌株與耐藥表型的關(guān)系

從表3中可看出，25株TBM分離株中MDR-TBM 占12.0%（3/25），XDR-TBM占4.0%（1/25），耐氟喹諾酮類的菌株占8.0%（2/25），都屬于北京型；任意耐藥的菌株占48.0%（12/25），83.3%（10/12）是北京型；全敏感的菌株占52.0%（13/25），76.9% （10/13）是北京型。用SPSS 16.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn)，顯示北京基因型菌株耐藥率和非北京型菌株的耐藥率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 1.000）。

三、VNTR位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)共選取了25個(gè)特異性較好的VNTR位點(diǎn)，對(duì)TBM臨床分離菌株基因組進(jìn)行擴(kuò)增。

圖2 A和B檢驗(yàn)的是VNTR3820和Qub11b位點(diǎn)的多態(tài)性，結(jié)果顯示各菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物大小差別很大，分辨率最高。實(shí)驗(yàn)中有些擴(kuò)增位點(diǎn)可獲得完整的數(shù)據(jù)結(jié)果，如圖2A；但有些位點(diǎn)沒有清晰的條帶，需要經(jīng)過(guò)多次不同退火溫度的擴(kuò)增，才能獲得清晰的電泳條帶以判斷產(chǎn)物大小，如圖2B中19號(hào)TBM臨床分離株。最終，將實(shí)驗(yàn)獲得的25個(gè)VNTR位點(diǎn)的完整數(shù)據(jù)結(jié)果作聚類分析（圖3）。

圖1 Spoligotyping分型實(shí)驗(yàn)結(jié)果及聚類分析圖

表2 25株TBM臨床分離株在SpolDB 4.0中的Spoligotyping分型結(jié)果

表3 北京家族菌株與15種藥物耐藥的相關(guān)性

圖2 結(jié)核性腦膜炎臨床分離株在VNTR3820位點(diǎn)和Qubllb位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

四、VNTR結(jié)果

由于多個(gè)VNTR位點(diǎn)與Spoligotyping聯(lián)合使用的分辨率已經(jīng)能夠達(dá)到IS6110-RFLP水平，加之操作簡(jiǎn)便，現(xiàn)已基本取代了后者，成為對(duì) Mtb分型的標(biāo)準(zhǔn)方法。通過(guò)網(wǎng)站“http：//www.hpa-bioinfotools.org.uk/cgi-bin/DICI/DICI.pl”計(jì)算本實(shí)驗(yàn)中25個(gè)VNTR位點(diǎn)的HGDI值后，發(fā)現(xiàn)VNTR3820 （HGDI=0.877）、Qub11b（HGDI=0.803）、MIRU26（HGDI=0.744）、Qub26（HGDI=0.687）、VNTR1955（HGDI=0.621）對(duì)所有TBM臨床分離菌株有較高的分辨率。VNTR3820（HGDI=0.805）、Qub11b（HGDI=0.795）、MIRU26（HGDI=0.676）、Qub26（HGDI=0.648）對(duì)北京型TBM臨床分離株有較高分辨率。VNTR3820、Qub11b、MIRU26、Qub26、VNTR1955、Mtub04、MIRU10、MIRU31、MIRU39、Mtub39、ETRA、Mtub30、MIRU4、MIRU40、VNTR4120、ETRC、MIRU23、MIRU16、MIRU27、MIRU2對(duì)非北京型TBM臨床分離株有較高分辨率，HGDI值高于0.600。分辨率最差的位點(diǎn)是MIRU24，HGDI值＜0.400。通過(guò)上述公式算出25個(gè)位點(diǎn)對(duì)25株臨床分離株的綜合分辨率為0.997；成簇率為8%（2/25）。此外，VNTR將TBM臨床分離株分成完全獨(dú)立的24個(gè)基因型，可歸為3類；其中23和26號(hào)菌株成一簇，基因型一樣（圖3）。

討 論

一、TBM與肺結(jié)核在基因型方面的差異性

在此次研究中獲得了患者的一些基本信息（性別、年齡、既往史、結(jié)核病史、合并肺結(jié)核、一線藥治療診療情況、患者接觸史等），能確定彼此之間的流行病學(xué)聯(lián)系。從圖1、3中可以看出23和26號(hào)菌株成一簇，基因分型結(jié)果相同。查閱病歷資料后發(fā)現(xiàn)這2例患者住院日期相近，均為第一次入院，但所住醫(yī)院地處西安市不同片區(qū)，因此排除院內(nèi)感染的可能。2例患者性別均為男性，年齡均在7歲以下，都未患過(guò)肺結(jié)核，入院時(shí)根據(jù)臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行TBM評(píng)分［8］，均＞6分，送檢日期為同一天，腦脊液中分離培養(yǎng)Mtb時(shí)間均為2周左右，二者對(duì)一線藥物的抗結(jié)核治療均有效，腦脊液鏡下均未見抗酸桿菌，ESAT-6均為陽(yáng)性，腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞數(shù)均＞63%，中性粒細(xì)胞均＜10%，單核細(xì)胞均＞9%，漿細(xì)胞均為0.5%，腦脊液生化檢查發(fā)現(xiàn)葡萄糖含量均＜3.9 mmol/L，蛋白含量均＞0.4 g/ L，氯含量均低于125 mmol/L。但由于無(wú)法獲知2例患者入院前有無(wú)接觸或其他接觸史，無(wú)法判斷是否由相互傳染所致，因此只能推斷他們可能來(lái)自同一傳染源。

圖3 VNTR分型實(shí)驗(yàn)結(jié)果及聚類分析圖

本實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)TBM臨床分離株和肺結(jié)核臨床分離株結(jié)果都比較分散，具有各種基因型別［15］。選取的25個(gè)位點(diǎn)綜合分辨率高，HGDI值可達(dá)到0.997，其中Qub11b、MIRU26和Qub26分辨率最高，有文獻(xiàn)報(bào)道這25個(gè)位點(diǎn)用于肺結(jié)核的VNTR分型，分辨率也可＞0.900［15］；從Spoligotyping分型后在SpolDB 4.0中的家族類型中可以看出T1、T2、Beijing、LAM6型均可引起TBM，而這些基因型同樣可以引起肺結(jié)核；據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前中國(guó)最流行的是北京型菌株，北京型菌株是感染肺結(jié)核的優(yōu)勢(shì)菌株［16］。25個(gè)TBM臨床分離株均來(lái)自西北地區(qū)，以北京型為主，這點(diǎn)也與文獻(xiàn)報(bào)道的陜西地區(qū)肺結(jié)核聚類情況相似［17］。這些發(fā)現(xiàn)提示，北京型可能也是感染TBM的優(yōu)勢(shì)菌株并與其發(fā)病有關(guān)，TBM感染菌株與肺結(jié)核感染菌株在基因分型上可能沒有明顯差別。

二、TBM與肺結(jié)核在耐藥表型方面的差異性

25株TBM分離株中MDR-TBM占12.0% （3/25），XDR-TBM占4.0%（1/25），耐氟喹諾酮類的菌株占8.0%（2/25），都屬于北京型；任意耐藥的菌株占48.0%（12/25），其中83.3%（10/12）是北京型；全敏感的菌株占52.0%（13/25），其中76.9% （10/13）是北京型。耐氟喹諾酮類的菌株所占比例最少，耐一線藥物的菌株所占比例最高。越南有文獻(xiàn)報(bào)道，TBM耐多藥率（2.5%）要低于肺結(jié)核耐多藥率（5.9%）。因此，目前對(duì)于MDR-TBM的問(wèn)題還未普遍受到關(guān)注。印度有文獻(xiàn)報(bào)道，大多數(shù)TBM對(duì)一線藥敏感（82.2%），有12.5%對(duì)異煙肼耐藥［18］。本實(shí)驗(yàn)中可以看出中國(guó)MDR-TBM所占比例高于其他發(fā)展中國(guó)家，但仍低于中國(guó)耐多藥肺結(jié)核所占比例（25.6%）［19］。由此可以看出，北京型可能與TBM和MDR-TBM的發(fā)病有關(guān)，是肺結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎的優(yōu)勢(shì)菌株；雖然本實(shí)驗(yàn)中北京基因型菌株耐藥率和非北京型菌株的耐藥率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但很可能與樣本量少有關(guān)，因此不能就此下否定結(jié)論。此外，筆者也發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類藥物在治療肺結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎方面都具有較好的效果［20］，一線藥物對(duì)TBM的治療效果要優(yōu)于肺結(jié)核。

大多數(shù)人感染Mtb后引起的是肺結(jié)核，Mtb也可通過(guò)血腦屏障后引起TBM。本實(shí)驗(yàn)中25例患者有18例肺部有結(jié)核病灶，說(shuō)明大多數(shù)TBM患者可伴有肺結(jié)核，但不是每個(gè)TBM患者肺部都有結(jié)核病灶。被感染者感染的雖然都是 Mtb，但為何有些患者沒有患肺結(jié)核，卻有TBM？筆者認(rèn)為，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是存在特異性感染肺結(jié)核的菌株型別、特異性感染TBM的菌株型別和均可感染肺結(jié)核和TBM的菌株型別，如果患者僅感染了嗜腦組織的Mtb，肺部就不會(huì)有病灶。

但由于TBM的發(fā)病率、診斷率不高，臨床上可收集用于檢測(cè)的腦脊液量有限，加上Mtb為胞內(nèi)寄生菌，因此可從TBM患者腦脊液中分離培養(yǎng)獲得的菌株數(shù)量很少，導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有意義，不能充分說(shuō)明此假設(shè)的可靠性。若能擴(kuò)大樣本量，可能會(huì)使推斷更據(jù)說(shuō)服力。如果經(jīng)擴(kuò)大樣本量后能發(fā)現(xiàn)某些基因型只能導(dǎo)致TBM而不能導(dǎo)致肺結(jié)核，并且耐藥譜也不同，則對(duì)臨床用藥會(huì)有很大幫助。若發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致TBM的基因型均能導(dǎo)致肺結(jié)核，則對(duì)于只患TBM而未合并肺結(jié)核的患者來(lái)說(shuō)，原因有待探討。本實(shí)驗(yàn)可以看出，從TBM和肺結(jié)核患者體內(nèi)分離培養(yǎng)出的 Mtb具有相似基因型和耐藥譜，治療方法也沒有很大差別。這就說(shuō)明導(dǎo)致這種病因?qū)W差異性的原因與 Mtb的基因型和耐藥譜關(guān)系不大，可能與Mtb的嗜組織性、血腦屏障、人體免疫系統(tǒng)、人體遺傳多態(tài)性和特異感染途徑有關(guān)，從而造成不同組織的病理改變。此外，本課題對(duì)于TBM的基礎(chǔ)研究，很好地?cái)U(kuò)展了對(duì)結(jié)核病的研究范圍，有助于解決臨床上的諸多問(wèn)題。比如，同樣是不耐藥的 Mtb，為何對(duì)肺結(jié)核療效好的藥物對(duì)結(jié)核性腦膜炎的療效卻不好？相信這將是結(jié)核病基礎(chǔ)和臨床研究的新方向，值得每個(gè)學(xué)者為之探索發(fā)現(xiàn)。

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The characteristic analyses in genotype and drug resistance of clinical isolates from the patients with tuberculous meningitis

WANG Ting*，ZHAO Yan-lin，LIU Jia-yun，PANG Yu，ZHOU Yang，ZHAO Bing，ZHAO Gang.*Department of Neurology，Center for Clinical Laboratory Medicine，Department of Infectious Diseases，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China

ZHAO Gang，Email：zhaogang@fmmu.edu.cn

Objective To study the characteristics in genotype and drug resistance of clinical isolates from the patients with tuberculous meningitis.Methods Twenty-five clinical isolates from the patients with tuberculous meningitis（TBM）were analyzed by Spoligotyping，variable numbers of tandem repeats（VNTR），15 antituberculosis drug susceptibility testing methods，in which 15 drugs were as following：isoniazid，rifampicin，ethambutol，pyrazinamide，streptomycin，kanamycin，amikacin，capreomycin，moxifloxacin，ofloxacin，levofloxacin，para amino salicylic acid，ethionamide，prothionamide，cycloserine.Results Of 25 M.tuberculosis isolates，20（80.0%）were Beijing genotype，2 were T1 genotype，3 were other genotypes（including T2，LAM6，and unclassified genotype）. 12.0%（3/25）were multi-drug resistant（MDR），and 4.0%（1/25）strains were extensive drug-resistant（XDR）. 8.0%（2/25）strains were resistant to fluoroquinolones，all belong to Beijing genotype.48.0%（12/25）strains were resistant to any drug，in which 83.3%（10/12）were Beijing genotype；52.0%（13/25）strains were sensitive，in which 76.9%（10/13）strains were Beijing genotype.Conclusion Beijing genotype strains were possibly associated with drug-resistant tuberculosis and may act as the main epidemic strain of TBM.Few strains were resistant to fluoroquinolones，which may play an important role in TBM treatment.

Tuberculosis，meningeal； Mycobacterium tuberculosis； Genotype； Drug resistance，bacterial；Spoligotyping； Minisatellite repeats

2013-07-16）

（本文編輯：張曉進(jìn)）

國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2012ZX10003004）

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（王婷、趙鋼），檢驗(yàn)科（劉家云）；中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心 國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室（趙雁林、逄宇、周楊、趙冰）

趙鋼，Email：zhaogang@fmmu.edu.cn