趙 爽 陳 偉 賈云璐 鄭凌凌左艷霞 宋立榮

(1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢430072; 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

囊藻毒素(Microcystins, MCs)是一類由某些淡水藍(lán)藻(如： 微囊藻)產(chǎn)生的環(huán)狀七肽, 具有肝臟毒性效應(yīng)。隨著藍(lán)藻水華在世界范圍內(nèi)頻繁暴發(fā), MCs的環(huán)境歸趨相關(guān)研究成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[1,2]。我國(guó)的太湖、滇池和巢湖, 每年都會(huì)發(fā)生不同程度的藍(lán)藻水華。以太湖為例, 在水華嚴(yán)重暴發(fā)時(shí)期, 機(jī)械打撈藍(lán)藻水華并集中堆積于處理池中, 是我國(guó)目前較為有效的高生物量藍(lán)藻水華處理的應(yīng)急措施之一[3]。

生物降解被認(rèn)為是 MCs環(huán)境歸趨的主要途徑之一[4]。針對(duì) MCs的生物降解, 目前國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展了大量研究, 分離出多株MCs降解細(xì)菌, 并對(duì)其降解過(guò)程和機(jī)理作了較為深入的研究[5]。也有研究主要集中在自然水體和水凈化處理工藝及過(guò)程方面[6,7],但在大量藍(lán)藻水華收獲處理的條件下, MCs將如何歸趨、生物降解能否起到主導(dǎo)作用等科學(xué)問(wèn)題, 目前鮮有研究報(bào)道。本研究擬從太湖藍(lán)藻水華堆積處理池中分離MCs降解細(xì)菌并研究其降解特性, 從理論上揭示藍(lán)藻水華生物量堆積處理?xiàng)l件下 MCs的歸趨機(jī)制, 為發(fā)展有毒藍(lán)藻脫毒和資源化利用提供理論和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑和MCs提取

MC-LR和MC-RR標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)自瑞士Alexis公司。實(shí)驗(yàn)用MC-LR和MC-RR從實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的產(chǎn)毒微囊藻經(jīng)提取純化獲得[8,9], 并經(jīng)高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)其色譜純度>90%, 實(shí)驗(yàn)前經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌。實(shí)驗(yàn)所用試劑除甲醇為色譜純外,其余均為分析純。

1.2 MCs測(cè)定

以高效液相色譜(HPLC, LC 10A, Shimadzu)測(cè)定MCs, 條件為： 流動(dòng)相100%甲醇： 磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L, pH 3.0)=58： 42 (v/v), 流速1 mL/min,色譜柱Kromasil 100-5 C18(150 mm×4.6 mm), 進(jìn)樣體積10 μL, 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm。

1.3 MCs降解細(xì)菌的分離

表層藻水混合物和底部沉積物采集于2010年9月太湖北部藍(lán)藻水華堆積處理池, 梯度稀釋后涂布于R2A培養(yǎng)基[7], 28℃培養(yǎng)3—5d, 隨機(jī)挑取不同特征的單菌落于蛋白胨酵母膏液體培養(yǎng)基(PY培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L, 酵母膏5 g/L, pH 7.0)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期生物量4380 r/min離心5min, 去上清, 無(wú)菌水懸溶洗滌2次, 以無(wú)菌磷酸鈉鹽緩沖液(PBS, 0.1 mol/L,pH 7.0)懸溶并調(diào)A600=0.5, 分別加入MC-LR和MCR, 使其終濃度分別約2 μg/mL, 28℃避光120 r/min振蕩培養(yǎng)。間隔6h取樣, 11000 r/min離心10min后,取上清HPLC測(cè)定MCs濃度。

1.4 菌株的16S rDNA鑒定和MCs降解基因

分離得到46個(gè)細(xì)菌單菌落, 采用基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA, 采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F-1492R[10], 于PCR儀(MJ mini, BIO-RAD)中進(jìn)行PCR反應(yīng), 反應(yīng)條件： 95℃ 5min, 95℃ 30s,55℃ 30s, 72℃ 90s, 32 個(gè)循環(huán), 72℃ 10min, 產(chǎn)物純化回收測(cè)序。

為研究菌株SW1的MCs降解基因mlrA的同源序列, 及環(huán)境樣品中是否含有mlrA基因, 進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)： 處理池表層藻水混合物樣品和同期內(nèi)太湖梅梁灣表層水, 經(jīng) 0.2 μm (GTTP, Millipore)過(guò)濾, 對(duì)濾膜和處理池藻泥沉積物提取總DNA (PowerSoil DNA Isolation Kit, MOBIO)。MCs降解基因mlrA的PCR引物和反應(yīng)條件等參考Bourne,et al.和Saito,et al.的研究[11,12]。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳, EB染色成像。另回收SW1的PCR產(chǎn)物并測(cè)序。

1.5 pH對(duì)SW1生長(zhǎng)的影響

在水華嚴(yán)重暴發(fā)時(shí)期及藍(lán)藻水華堆積處理池中,水體常呈堿性, 為研究 pH對(duì)SW1生長(zhǎng)的影響, 于PY培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)SW1至對(duì)數(shù)期, 接種于不同pH的培養(yǎng)基并考察SW1的增殖。以0.1 mol/L PBS配制PY培養(yǎng)基, 并以0.1 mol/L 磷酸和4 mol/L NaOH調(diào)pH, pH梯度范圍為5.91—11.97。培養(yǎng)條件同降解實(shí)驗(yàn), 間隔取樣測(cè)定A600值。

1.6 SW1對(duì)MCs的降解

為考察溫度和pH對(duì)SW1降解MCs的影響, 以PBS(0.1 mol/L, pH 7.0)懸溶SW1并調(diào)A600=0.5, 取2 mL該菌液于玻璃試管, 加入MC-LR或MC-RR使其終濃度為 1.8 μg/mL。溫度梯度為 4、15、22、28和37℃; pH梯度范圍為5.91—7.86 (0.1 mol/L PBS),7.93—10.02 (0.1 mol/L 硼酸鈉鹽)。避光150 r/minm振蕩培養(yǎng)(pH實(shí)驗(yàn)時(shí)溫度為 28℃), 每 6h取樣測(cè)定反應(yīng)體系中MCs的變化。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果并參考已有研究報(bào)道[13,14],結(jié)合藍(lán)藻水華堆積處理池現(xiàn)場(chǎng)數(shù)據(jù), 設(shè)置溫度28℃、pH 7.0, 其他條件同上, 研究了SW1對(duì)MCs的降解動(dòng)力學(xué)特征。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)分析軟件和Origin 8軟件。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定

SW1在R2A固體培養(yǎng)基中菌落呈圓形, 直徑一般<1 mm, 白色半透明有光澤。SW1革蘭氏染色呈陰性, 桿狀。將16S rDNA基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST, 并以MEGA5軟件采用鄰位連接法(Neighbor Joining, 1000 bootstrap replicates)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1, 加下劃線標(biāo)注為目前已報(bào)道的MCs降解菌株), 結(jié)果表明該菌株可定屬于Sphingopyxissp.。

2.2 pH對(duì)SW1生長(zhǎng)的影響

對(duì)不同pH的增殖響應(yīng)表明, SW1對(duì)中性和弱堿性具有良好的適應(yīng)性(圖2)。在pH 6—9的條件下培養(yǎng)24h后, 生物量增加了10倍以上; 在pH 10—11的強(qiáng)堿性條件下, SW1則生長(zhǎng)變緩甚至幾乎不能生長(zhǎng)。

2.3 溫度和pH對(duì)SW1的MCs降解活性影響

SW1在 28—37℃具有很強(qiáng)的降解活性, 能在6h內(nèi)降解超過(guò)80%的MC-LR和70%的MC-RR (圖3)。SW1對(duì)MC-LR和MC-RR的降解最適溫度約在30℃, 在同一溫度下對(duì) MC-LR的降解速率高于MC-RR。在中性和弱堿性(pH 7—8)條件下, SW1具有高的MCs降解活性, 能夠在6h內(nèi)降解80%以上的MC-LR和MC-RR(圖4); 在強(qiáng)堿性條件下活性顯著下降, 在 pH 10時(shí), SW1僅能降解大約 20%的MC-LR和MC-RR。SW1對(duì)MC-RR和MC-LR降解的pH響應(yīng)是不同的。在pH 6.5—9, SW1對(duì)MC-LR的降解超過(guò) 80%, 而對(duì) MC-RR的最適 pH范圍是7—8。

圖1 基于16S rDNA基因序列的SW1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of microcystin degrading bacterium SW1 based on 16S rDNA gene sequence

2.4 降解動(dòng)力學(xué)

擬合降解動(dòng)力學(xué)曲線表明(圖 5), SW1對(duì)MC-LR和MC-RR的降解具有一級(jí)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征, 其對(duì)MC-LR和MC-RR的降解速率方程、降解反應(yīng)速率常數(shù)k、降解半衰期t1/2和相關(guān)系數(shù)R2(表1)。對(duì) MC-LR和 MC-RR的降解速率常數(shù)分別為0.35/h、0.28/h, 平均降解速率為分別為 0.20 μg/(mL·h)、0.12 μg/(mL·h) (MC-RR初始濃度各為1.8 μg/mL, 初始細(xì)菌濃度A600=0.5)。

2.5 降解基因mlrA的鑒定

PCR結(jié)果顯示, 菌株 SW1、處理池表層藻水混合物和太湖北部表層水的mlrA基因 PCR反應(yīng)呈陽(yáng)性(圖6), 表明SW1和藍(lán)藻水華堆積處理池的細(xì)菌中含有mlrA的同源基因,說(shuō)明藍(lán)藻水華堆積處理池中存在MCs的生物降解。SW1和已報(bào)道的其他MCs降解菌的mlrA同源基因相似度很高(84%—99%, 表2)。而堆積池沉積物中未檢測(cè)出mlrA基因。

3 討論

SW1對(duì)MC-LR和MC-RR的降解具有一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征, 降解速率高于目前已報(bào)道的幾株毒素降解細(xì)菌, 如： ACM-3692、7CY、LH21、EMS和THN1等, 但小于Y2、MD-1、B9、J10 和 C1 (表 3)。造成降解速率和降解反應(yīng)速率常數(shù)不同的原因除了細(xì)菌菌株本身的特性,還與MCs和細(xì)菌的初始濃度、培養(yǎng)條件有關(guān), 前培養(yǎng)處理也是影響降解活性的要素[13,15,21]。研究表明SW1對(duì)不同MCs的異構(gòu)體降解速率不同, 對(duì) MC-LR降解速率高于MC-RR (圖 3、4), 這與 ACM-3692、J10相似, 但不同于MD-1、7CY, 其原因除了可能跟菌株自身特性(如MCs降解酶對(duì)相似底物不同的親和力), 還與不同MCs異構(gòu)體本身的性質(zhì)(如相同pH下不同的帶電性質(zhì))有關(guān)。然而, Park,et al.的研究發(fā)現(xiàn),MCs降解細(xì)菌 Y2在同一條件下對(duì)不同濃度的MCs異構(gòu)體降解速率是變化的, 即高濃度的 MC-RR降解速率高于 MC-LR, 低濃度則反之[15]。而在自然水體中是否存在相似現(xiàn)象, 仍有待進(jìn)一步研究。

溫度是影響SW1降解活性的重要因素, 不同溫度下 SW1表現(xiàn)出不同的 MCs降解活性, 其最適降解溫度約在30℃, 這與另一株MCs降解菌LH21相似[7]。夏秋季節(jié)太湖的平均水溫一般約在26—32℃,在此期間由藍(lán)藻水華暴發(fā)產(chǎn)生的 MCs也會(huì)被更快速地降解; 而對(duì)于藍(lán)藻水華堆積處理池由于本身較淺且處于露天環(huán)境, 池內(nèi)溫度一般高于太湖水溫,MCs的降解速率很可能更高。

圖2 pH對(duì)SW1生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of pH on the growth of SW1

圖3 溫度對(duì)SW1的MCs降解活性影響Fig.3 Effect of temperature on the degradation activity of SW1

圖4 pH對(duì)SW1降解活性的影響Fig.4 Effect of pH on the degradation activity of SW1

圖5 MC-LR和MC-RR降解曲線Fig.5 Degradation curve of MC-LR and MC-RR

表1 降解速率方程Tab.1 Equation of degradation rate

圖6 SW1、藍(lán)藻水華堆積處理池和太湖湖水中 mlrA基因的PCR檢測(cè)Fig.6 PCR detection of mlrA gene in SW1, treatment ponds and lake water of Lake Taihu

pH也是影響SW1的MCs降解活性, 在中性和偏堿性條件下能對(duì)MC-LR和MC-RR快速降解, 這和已報(bào)道的幾株MCs降解細(xì)菌相似[14,16,18]。研究表明MC-LR的高降解活性pH區(qū)間范圍大于MC-RR,其可能原因除了SW1對(duì)MCs異構(gòu)體降解的選擇性差異, 以及細(xì)胞代謝功能因體系 pH改變細(xì)胞質(zhì)膜電荷而受到影響的可能原因外, 還可能與MCs異構(gòu)體自身的結(jié)構(gòu)和電荷特性有關(guān)。

同時(shí) SW1生長(zhǎng)的堿性耐受研究表明其能在中性和偏堿性條件下生長(zhǎng), 但不適于強(qiáng)堿性環(huán)境, 這也與之前的研究結(jié)果相似[14,18]。藍(lán)藻水華發(fā)生的水體上層因藍(lán)藻的光合活性 pH呈較強(qiáng)堿性[22,23], 而在處理池中藻水混合物pH相對(duì)較低, 一般在6.9至8.8, 這與SW1對(duì)MCs高降解活性的pH區(qū)間大致是相吻合的, 因此藍(lán)藻死亡裂解后釋放的MCs可以被更快速降解, 所以處理池的pH并不是SW1類降解菌的降解活性限制因子。MC-LR的高降解活性pH區(qū)間范圍大于MC-RR, 除了SW1對(duì)MCs異構(gòu)體降解的選擇性差異, 以及細(xì)胞代謝功能因體系 pH改變細(xì)胞質(zhì)膜電荷而受到影響的可能原因外, 還可能與MCs異構(gòu)體自身的結(jié)構(gòu)和電荷特性有關(guān)。

表2 SW1和已報(bào)道MCs降解細(xì)菌的mlrA基因相似性比較Tab.2 Similarities of mlrA gene between SW1 and reported MCs-degrading bacteria

藍(lán)藻水華水體及藻的膠被中存在有大量細(xì)菌[24,25], 能夠代謝降解包括藍(lán)藻毒素在內(nèi)的生物有機(jī)質(zhì)并促進(jìn)水體的自我凈化[26—28], 即使受自然環(huán)境因素影響, 生物降解仍為水體中大多數(shù)微囊藻毒素的主要?dú)w宿[4]。所有具有mlrA同源基因的 MCs降解菌并不只降解 MCs, 對(duì)藍(lán)藻合成的其他一些環(huán)多肽也具有降解活性[29]。一般研究認(rèn)為MCs降解細(xì)菌能夠有效地對(duì)MCs進(jìn)行脫毒[30,31], 但藍(lán)藻水華堆積處理池不同于一般的藻華水體和水處理工藝, 有其不同之處(如高有機(jī)質(zhì)、高濃度毒素釋放等), 這會(huì)促使其中土著和外源(藍(lán)藻水華)進(jìn)入的微生物群落結(jié)構(gòu)和種群數(shù)量發(fā)生變化, 同時(shí)大量可降解的有機(jī)質(zhì)也會(huì)與MCs發(fā)生代謝競(jìng)爭(zhēng), 進(jìn)而對(duì)MCs的生物降解造成影響[32—34]。以 PCR對(duì)藍(lán)藻水華堆積處理池和水華暴發(fā)區(qū)域mlrA基因檢測(cè)呈陽(yáng)性表明, 處理池很可能存在與已報(bào)道相似的MCs降解途徑[29,31,35]。處理池沉積物樣品中mlrA基因 PCR檢測(cè)呈陰性, 是否具有與一般湖泊沉積物對(duì)MCs的降解作用[36], 仍需進(jìn)一步研究。SW1所表現(xiàn)出的 MCs降解特性可能與在藍(lán)藻水華堆積處理池特殊環(huán)境下的馴化有關(guān),一些細(xì)菌(如SW1)在一定環(huán)境下(如高水溫和弱堿性)很可能在MCs快速降解過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。在自然環(huán)境下, Jones,et al.觀察到雙相降解動(dòng)力學(xué)(Bi-phasic degradation kinetics), 即快速降解相(包括之前的延滯期)和遲緩降解相, 并將這種現(xiàn)象的原因歸納為兩個(gè)獨(dú)立的細(xì)菌類群： 一類能利用 MC-LR作為碳源和能源, 另一類共代謝低含量的MC-LR[2]。在對(duì)藍(lán)藻水華堆積處理池MCs降解模擬實(shí)驗(yàn)研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的雙相降解動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象(結(jié)果未發(fā)表), 從這一角度講, SW1很可能屬于快速代謝MCs的細(xì)菌種類。SW1的分離來(lái)源——藍(lán)藻水華堆積處理池中的生物量來(lái)源于太湖, 也有關(guān)于太湖MCs降解細(xì)菌的研究報(bào)道[17,18,20], 但目前為止并未能從處理池中分離到已報(bào)道的MCs降解菌株, 這是否與處理池的非自然條件有關(guān), 與其他MCs降解細(xì)菌相比SW1是否具有特殊之處, 有待進(jìn)一步的研究。處理高通量的藍(lán)藻水華能否有效去除 MCs, 與藻華水體中MCs的降解有怎樣的異同[37], 目前尚缺乏相關(guān)研究和結(jié)論。從藍(lán)藻水華堆積處理池中分離MCs降解細(xì)菌并進(jìn)行特性研究對(duì)于回答和解決上述問(wèn)題非常關(guān)鍵, 對(duì)于進(jìn)一步研究藍(lán)藻水華脫毒和資源化利用也具有重要價(jià)值[30,38]。

4 結(jié)論

從藍(lán)藻水華堆積處理池中分離獲得具有 MCs高降解活性的菌株SW1, 經(jīng)16S rDNA鑒定為鞘氨醇單胞菌(Sphingopyxissp.); 在實(shí)驗(yàn)條件下SW1能分別在 9h、15h完全降解 1.8 μg/mL的 MC-LR和MC-RR, 并具有一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征, 其反應(yīng)速率常數(shù)分別為0.35/h和0.28/h; 溫度和pH是影響SW1對(duì)MCs降解活性的因素, 溫度約30℃, pH中性和弱堿性, 具有高降解活性; 在中性及偏堿性條件下(pH 6—9)SW1能快速增殖; SW1具有mlrA的同源基因,在藍(lán)藻水華堆積處理池的上層藻水混合物中也含有具有mlrA同源基因的細(xì)菌。

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