丁 奕 甘南琴 鄭凌凌 宋立榮

(1.中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072;2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人們生活所產(chǎn)生的污水排放量的增加, 湖泊富營養(yǎng)化和藍(lán)藻水華暴發(fā)已成為國內(nèi)外普遍關(guān)注的環(huán)境問題[1—4]。從20世紀(jì)60年代開始, 人們一直致力于研究控制藍(lán)藻水華的技術(shù), 一般來說物理法和化學(xué)法是除藻的最直接手段。物理法主要包括機(jī)械或人工打撈、黏土絮凝和遮光技術(shù)等方法, 不會產(chǎn)生二次污染, 但是由于昂貴的費(fèi)用,該方法只能局限于小水體或大水體的局部水域?；瘜W(xué)法的時間效應(yīng)比較快, 如硫酸銅、氯化物、高錳酸鉀、重金屬制劑等, 但由于其對除藍(lán)藻外的其他生物的副作用造成環(huán)境污染或破壞生態(tài)平衡等缺點(diǎn)而受到限制[5]。過氧化氫(H2O2)氧化性強(qiáng), 安全易得,且其分解產(chǎn)物是水和氧氣, 不會產(chǎn)生新的污染物,因此, 過氧化氫被稱為綠色氧化劑, 常作為一種環(huán)保有效的殺藻劑[6]。Qian,et al.報(bào)道H2O2通過阻斷光合作用相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄或破壞光合色素來抑制藻類的生長[7]。Barrington 和 Ghadouani利用 H2O2方法誘導(dǎo)藍(lán)藻和其他浮游植物死亡, 發(fā)現(xiàn)H2O2去除藍(lán)藻效果比去除綠藻和硅藻更好[8]。

藍(lán)藻水華污染所帶來的主要危害之一是藻毒素。在已發(fā)現(xiàn)的各種藻毒素中, 微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是一類出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴(yán)重的藻毒素[9]。目前所檢測到的微囊藻毒素異構(gòu)體已超過80種[10], MC-LR是毒性最大并且存在最廣泛的一類。長期以來, 微囊藻毒素產(chǎn)生的生物學(xué)意義和功能一直受到科學(xué)研究者的關(guān)注, 但進(jìn)展甚微。Babica,et al.[11]提出化感作用假說, 認(rèn)為MCs對浮游藻類的光合作用、生長、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等有抑制作用。Schatz,et al.[12]的研究發(fā)現(xiàn), 無論是程序性死亡還是受到各種脅迫所引起的微囊藻細(xì)胞裂解,其后釋放的MCs能誘導(dǎo)生存下來的微囊藻McyB的大量積累, 從而促進(jìn)其微囊藻 MCs的產(chǎn)生, 提高對環(huán)境的適應(yīng)性。Sedmak,et al.[13]的研究發(fā)現(xiàn),500 μg/L的MCs能使微囊藻的形態(tài)和生理特征發(fā)生改變, 促進(jìn)單細(xì)胞微囊藻積聚成群體。甘南琴等[14]研究表明微囊藻毒素 MCs能促進(jìn)微囊藻群體尺寸增大, MCs濃度越高, 群體尺寸越大。Utkilen和Gj?lme[15]的研究表明 MCs可作為胞內(nèi)金屬離子螯合劑而減輕金屬離子對微囊藻的毒性。之前我們的研究結(jié)果表明, H2O2可依劑量誘導(dǎo)微囊藻細(xì)胞產(chǎn)生類細(xì)胞凋亡[6], 同時H2O2脅迫會導(dǎo)致微囊藻毒素的釋放, 且胞外毒素的釋放可能刺激胞內(nèi)毒素的產(chǎn)生。我們推測MCs可能也參與了微囊藻響應(yīng)H2O2脅迫的生理生化過程。它對H2O2脅迫下藻細(xì)胞的某些生理改變能否施加影響？有關(guān)這方面的信息還未見報(bào)道, 本文對此作了初步的探討。本實(shí)驗(yàn)通過使用外源MC-LR, 研究MC-LR對H2O2脅迫下銅綠微囊藻生理生化變化的影響有利于闡明 H2O2脅迫影響產(chǎn)毒藍(lán)藻的生長代謝的信號途徑和 MCs生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 藻種和藻種培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用產(chǎn)毒銅綠微囊藻 FACHB-905取自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB-collection)。本實(shí)驗(yàn)以 BG11培養(yǎng)基為培養(yǎng)介質(zhì), 正常培養(yǎng)條件下, 溫度 25℃, 光強(qiáng)為 25 μE/(m2?S), 光暗周期為12∶12。初始濃度A680=0.15接入250 mL三角瓶7—12d的培養(yǎng)物視為處于健康生長狀態(tài)。

1.2 H2O2和MC-LR處理

離心收集健康生長的藻細(xì)胞, 無菌水清洗 3遍后, 置于BG11培養(yǎng)基中, 計(jì)算接種所需用量, 等待接入50 mL三角瓶中。正常生長條件(培養(yǎng)基未添加其他物質(zhì))作為對照組(Control)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個處理組： (1)250 μmol/L H2O2處理, (2)250 μmol/L H2O2+200 ng/mL MC-LR 處理, (3) 350 μmol/L H2O2處理,(4) 350 μmol/L H2O2+200 ng/mL MC-LR 處理。接種終濃度A680控制在0.4左右, 終體系為30 mL, 每組設(shè)3個平行。本研究所用的微囊藻毒素MC-LR購自于臺灣藻類研究公司(Taiwan Algal Science Inc,≥95% HPLC)。

1.3 樣品微囊藻毒素檢測

為了檢測本實(shí)驗(yàn)H2O2濃度對MC-LR是否有降解作用, 采用HPLC方法分別在24h和48h檢測毒素含量, 參考 Kaya和 Sano[16]。所用色譜柱為島津ODS柱(4.6 mm×150 mm), 檢測波長238 nm, 流動相為60%甲醇, 40%磷酸緩沖液(0.05 mol/L KH2PO4,20%H3PO4調(diào)節(jié) pH=3.0), 流速為 1.0 mL/min, 進(jìn)樣量 10 μL。

1.4 MTT染色

藻細(xì)胞活性檢測采用MTT染色法, 參考Li,et al.[17]的方法。其染色原理是水溶性無色或淺色的四唑類化合物, 在活細(xì)胞體內(nèi)被還原成水不溶性藍(lán)紫色的甲化合物(Formazan), 而死細(xì)胞體內(nèi)不能生成甲。MTT溶于0.05 mol/L PBS(pH 6.8)中, 濃度為0.5 g/L, 同時加入0.1 mol/L琥珀酸鈉, 保存于4℃。取250 μL樣品, 1/2 BG11清洗后懸浮于250 μL 1/2 BG11中開始染色。將250 μL樣品與100 μL MTT儲存液混合, 染色在(35±1)℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行,染色1h。染色后, 8000 r/min 3min離心去掉染色液,將藻細(xì)胞懸浮于250 μL蒸餾水中, 取8 μL于血球計(jì)數(shù)板中在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù), 計(jì)算染色后陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。

1.5 光合系統(tǒng)活性測定

參考吳忠興[18], 用 Phyto-PAM(Heinz Walz,Effeltrich, Germany)測定其光系統(tǒng)Ⅱ活性Fv/Fm和最大光電子傳遞速率ETRmax。取活體藻樣2 mL, 暗適應(yīng)15min以保證電子傳遞鏈氧化。

1.6 類胡蘿卜素(Carotenoids)和葉綠素含量(Chl.a)的測定

測得方法參考吳忠興[18]。取3 mL藻樣, 7000 r/min轉(zhuǎn)速離心3min, 棄上清液, 加入3 mL 80%的丙酮,低溫暗處靜置 24h提取脂溶性色素。24h后 10000 r/min離心5min, 取上清液分別測定663 nm和450 nm的光吸收值。根據(jù)下式分別計(jì)算色素的含量：

1.7 活性氧(ROS)含量測定

銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi) ROS 用二氯二氫熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)檢測。DCFH-DA 能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),被酯酶分解為 DCFH, DCFH 與 H2O2等小分子過氧化物結(jié)合而被氧化成具有熒光性的DCF。其激發(fā)光波長為485 nm, 發(fā)射光為525 nm。分別在接種后第 24h 和第 48h 取樣, 離心, 重懸于 100 mmol/L PBS (pH 7.2)緩沖液中, 再用PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞2 次, 再重懸于PBS 緩沖液, 向其中加入DCFH-DA使其終濃度為10 μmol/L, 37℃避光溫育1h, 以PBS洗滌 2 次, 再重懸于的 PBS 緩沖液用酶標(biāo)儀(Molecular Device, M2, CA, USA)檢測熒光強(qiáng)度。

1.8 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活性測定

取適量藻樣 7000 r/min, 離心 3min 后, 將藻泥懸浮于3 mL 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.8)中, 超聲波破碎共 3min, 每超聲 20s, 停 10s,8000 r/min冷凍離心15min, 取上清液用于蛋白含量與酶活測定。超氧化物歧化酶(SOD)的測定采用改良的NBT光化還原法[19]。以抑制NBT光化還原50%作為一個酶活力單位計(jì)算比活。蛋白質(zhì)濃度的測定采用考馬斯亮藍(lán)-G250 染色法[20]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)各組均設(shè)三個平行, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和圖的繪制采用統(tǒng)計(jì)軟件Origin 8.0(Origin Lab, USA)。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對MC-LR的降解

當(dāng)微囊藻毒素MC-LR暴露于250 μmol/L H2O2時, H2O2很難氧化MC-LR, 在 24h和48h處理后, MCLR濃度和初始濃度值相差不大(圖1)。當(dāng)微囊藻毒素MC-LR暴露于350μmol/L H2O2時,處理48h后才有輕微的降解, MC-LR濃度為初始濃度的86.4%。

圖1 250 和 350 μmol/L H2O2對 200 ng/mL MC-LR降解的影響Fig.1 Effect of 250 and 350 μmol/L H2O2 treatments on degradation of MCLR

2.2 MC-LR對H2O2脅迫下微囊藻生長的影響

在H2O2脅迫下, 加入或未加入MC-LR的微囊藻的生長都受到顯著抑制(圖2)。在250和 350 μmol/L H2O2處理9h后, 加入MC- LR的微囊藻存活率明顯高于未加入MC-LR的微囊藻(圖3)。隨著時間的變化, 250 μmol/L H2O2處理微囊藻在加入MC-LR的情況下存活率一直高于未加入 MC-LR的微囊藻。但是350 μmol/L H2O2處理24h和48h后加入了MC-LR和未加入MC-LR的微囊藻存活率差異不大。

圖2 培養(yǎng)基中加入和未加入外源MC-LR分別對H2O2脅迫下微囊藻生長的影響Fig.2 Effect of MC-LR on the growth of M.aeruginosa cells under 250 and 350 μmol/L H2O2 treatments.Control represents untreated cells

2.3 MC-LR對 H2O2脅迫下微囊藻光合系統(tǒng)Ⅱ活性的影響

在 H2O2脅迫下, MC-LR對微囊藻Fv/Fm和ETRmax的影響作用相同, 且受微囊藻細(xì)胞所處的H2O2濃度影響(圖 4)。250 和 350 μmol/L H2O2都會使微囊藻的 PSⅡ活性降低, 其抑制作用在 3h后就可以檢測到, 而此時 MC-LR的作用尚不明顯。24h和48h后, 在培養(yǎng)基中加入的MC-LR可以緩解250μmol/L H2O2對微囊藻Fv/Fm和ETRmax的抑制作用。但是隨著 H2O2濃度的增加, H2O2對微囊藻的 PSⅡ活性的抑制作用也越強(qiáng),Fv/Fm和ETRmax已降到PAM 檢測線以下, 加入的 MC-LR不能夠減輕 350μmol/L H2O2對微囊藻Fv/Fm和ETRmax抑制作用。

2.4 MC-LR在 H2O2脅迫下對微囊藻類胡蘿卜素/葉綠素含量的影響

從圖5可以看出, 250 μmol/L H2O2處理24h后和同濃度并加入 MC-LR處理組的類胡蘿卜素/葉綠素含量的比值沒有顯著變化, 分別為0.389和0.363。而 250 μmol/L H2O2處理48h后, 加入MC-LR比未加入 MC-LR的比值高(P<0.05), 說明 MC-LR使類胡蘿卜素所占比例得到提高。350 μmol/L H2O2處理48h后類胡蘿卜素和葉綠素含量比值明顯下降, 加入的MC-LR不能夠減輕350 μmol/L H2O2對光合色素的破壞作用。

2.5 MC-LR在 H2O2脅迫下對微囊藻細(xì)胞內(nèi) ROS含量和SOD活性的影響

在 250 和 350 μmol/L H2O2處理后, 微囊藻細(xì)胞內(nèi) ROS含量急劇上升, 在處理后的第 48h, 微囊藻細(xì)胞內(nèi)ROS含量分別為對照的3.3和8.7倍(圖6)。但是 48h后, 當(dāng)微囊藻暴露于250 μmol/L H2O2環(huán)境中時, 添加了 MC-LR使細(xì)胞中的ROS含量明顯減少(P<0.05), 但仍高于正常條件下微囊藻的ROS含量。從圖 7可知, 與對照相比, 24h后H2O2處理組和250 μmol/L H2O2+MC-LR處理的SOD活性都有上升, 表明微囊藻對處理有一定的應(yīng)激反應(yīng)。同時,添加了 MC-LR的藻細(xì)胞SOD活性低于沒有加入MC-LR的藻細(xì)胞活性。隨著時間的推移, 在相同濃度 H2O2且加入了外源MC-LR后的48h, SOD活性急劇下降(P<0.05)。

圖3 培養(yǎng)基中加入和未加入外源MC-LR分別對 H2O2脅迫下微囊藻細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of MC-LR on cell viability of M.aeruginosa under 250 and 350μmol/L H2O2 treatments Control represents untreated cells

圖4 培養(yǎng)基中加入和未加入外源MC-LR分別對 H2O2脅迫下微囊藻光合系統(tǒng)Ⅱ活性(Fv/Fm, ETRmax)的影響Fig.4 Effect of MC-LR on PSⅡ activity of M.aeruginosa under 250 and 350μmol/L H2O2 treatments

3 討論

圖5 培養(yǎng)基中加入和未加入外源MC-LR分別對H2O2脅迫下微囊藻細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素/葉綠素比值的影響(“* ” 代表 P < 0.05)Fig.5 Effect of MC-LR on carotenoid and chla contents of M.aeruginosa under 250 and 350 μmol/L H2O2 treatments(“* ” is P <0.05)

圖6 培養(yǎng)基中加入和未加入外源MC-LR分別對H2O2脅迫下微囊藻細(xì)胞中 ROS 含量的影響 (“* ” 代表 P < 0.05)Fig.6 Effect of MC-LR on intracellular ROS of M.aeruginosa under 250 and 350 μmol/L H2O2 treatments Measured ROS is expressed as Fluorescence Intensity.The value represent mean ± SE of three replicate (“* ” is P < 0.05)

圖7 培養(yǎng)基中加入和未加入外源MC-LR分別對H2O2脅迫下微囊藻細(xì)胞 SOD 活性的影響(“* ” 代表 P < 0.05)Fig.7 Effect of MC-LR on SOD activities of M.aeruginosa under 250 and 350 μmol/L H2O2 treatments(“* ” is P < 0.05)

微囊藻是世界各地最常發(fā)生水華的藍(lán)藻, 且對于飲用水的危害也是各國矚目的重點(diǎn)。在高光強(qiáng)下水體表面會形成自然光化學(xué)產(chǎn)物H2O2, 且在淡水中其濃度能達(dá)到10?5mol/L[21]。一方面, 由于經(jīng)常暴露于變化的環(huán)境中, 藍(lán)藻自身也經(jīng)常產(chǎn)生H2O2以應(yīng)對各種脅迫包括光強(qiáng)和溫度的劇烈波動等等。另一方面, 由于過氧化氫可以迅速分解成氧和水, 經(jīng)常作為一種殺藻劑[6]。大部分的藍(lán)藻毒素都存在于細(xì)胞中, 只有當(dāng)細(xì)胞死亡裂解時, 毒素才會被釋放出來到水體中[22]。微囊藻毒素的大量產(chǎn)生可能有助于提高微囊藻群體的適應(yīng)性以及與其他浮游植物的競爭力[11,23]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 與單獨(dú)的 250 μmol/L H2O2處理相比,外源MC-LR的添加增加了H2O2脅迫下微囊藻細(xì)胞的存活率, 緩解由H2O2毒害造成光系統(tǒng)PSII活性的減少。但是350 μmol/L H2O2處理24h和48h后加入了MC-LR和未加入MC-LR的微囊藻細(xì)胞存活率差異不大, 說明高濃度350 μmol/LH2O2脅迫對藻細(xì)胞的傷害程度超過了其抵御能力, 從而不能減輕H2O2的負(fù)面影響。究其根本原因, 可能跟 MC是否參與程序性細(xì)胞死亡(PCD)信號傳遞途徑有關(guān)。微囊藻雖然是單細(xì)胞生物, 但在自然條件下主要以群體形式存在。之前我們研究發(fā)現(xiàn)250 μmol/L H2O2可誘導(dǎo)微囊藻細(xì)胞產(chǎn)生類細(xì)胞凋亡(AL-PCD), 且導(dǎo)致微囊藻毒素的釋放[3], 而高濃度的350 μmol/L H2O2可造成微囊藻細(xì)胞壞死。PCD從種群中移除受損的或者破壞了的細(xì)胞, 為同種群其他細(xì)胞提供生存機(jī)會[24]。有研究表明UV-C處理過的Chlamydomonas reinhardtii培養(yǎng)物中獲得培養(yǎng)基可以改善C.reinhardtii再次受到UV-C脅迫時的生存能力, 使UV-C所致的死亡減少20%[25]。Schatz,et al.[9]的研究發(fā)現(xiàn), 微囊藻細(xì)胞裂解釋放的 MCs能被存活下來的微囊藻細(xì)胞感知并導(dǎo)致胞內(nèi) McyB大量積累, 從而促進(jìn)其微囊藻MCs的產(chǎn)生, 提高對環(huán)境的適應(yīng)性。Dittmann,et al.[26]發(fā)現(xiàn)兩種微囊藻毒素相關(guān)蛋白質(zhì)MrpA和MrpB與豌豆根瘤菌Rhizobium leguminosarum中的群體感應(yīng)蛋白RhiA和RhiB顯示出相似性, 認(rèn)為毒素的存在是藍(lán)光影響微囊藻 MrpAB表達(dá)的先決條件。Zilliges,et al.[27]發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素與胞內(nèi)一些蛋白綁定, 并且這種綁定在高光強(qiáng)和氧化應(yīng)激條件下得到顯著增強(qiáng)。據(jù)此推測外源MC-LR可能參與了微囊藻響應(yīng)H2O2脅迫的AL-PCD過程, 從而提高微囊藻的生存力。當(dāng)然要證明這一觀點(diǎn)還需要更多的數(shù)據(jù)支持, 微囊藻毒素的信號傳遞途徑還需要深入研究,其中胞內(nèi)與胞外毒素之間的協(xié)同作用值得重視。

ROS是外源性氧化劑或細(xì)胞內(nèi)有氧代謝過程所產(chǎn)生的具有很高生物活性的含氧化合物的總稱, 包括超氧陰離子(O2-) 、羥自由基(OH-) 、過氧化氫(H2O2) 等[28]。在正常情況下, 植物細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生和清除是平衡的。但是, 當(dāng)植物體遭受外來脅迫時, ROS的產(chǎn)生和清除則失去平衡, 會產(chǎn)生過量的 ROS, 導(dǎo)致氧脅迫, 并進(jìn)而使得細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷和生理代謝紊亂[29]。近期的研究發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素的釋放可能與過氧化壓力或細(xì)胞的程序性死亡有關(guān),外源H2O2使得微囊藻細(xì)胞內(nèi)ROS增加且伴隨著微囊藻毒素的釋放[30,31]。在本研究中, 250 和 350 μmol/L H2O2處理后, 微囊藻細(xì)胞內(nèi) ROS含量急劇上升;48h后, 當(dāng)微囊藻暴露于250 μmol/L H2O2環(huán)境中時,添加了MC-LR處理組細(xì)胞中的ROS含量明顯減少(P<0.05)。這表明H2O2確實(shí)對微囊藻細(xì)胞產(chǎn)生了氧化脅迫, 而適當(dāng)外源MC-LR可減少ROS的積累, 緩解 H2O2誘導(dǎo)的氧化脅迫。SOD是植物體主要的內(nèi)源酶系自由基清除劑, 可以清除細(xì)胞內(nèi)過多的ROS,從而保護(hù)膜和大分子物質(zhì)[28]。本研究表明, H2O2處理組和250 μmol/L H2O2+MC-LR處理24h后的SOD活性都有上升, 但是添加了 MC-LR的藻細(xì)胞 SOD活性低于沒有加入 MC-LR的藻細(xì)胞活性。推測在H2O2脅迫下, ROS積累, 細(xì)胞膜透性增強(qiáng), 細(xì)胞膜損傷加劇; 外源MC-LR可能通過調(diào)控胞內(nèi)ROS的積累進(jìn)而影響SOD等抗氧化系統(tǒng)酶活性, 從而減輕藻細(xì)胞的氧化壓力并減弱細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述, 目前獲得的結(jié)果表明 MC-LR對H2O2脅迫下微囊藻的光合活性、色素 含量、酶活性等代謝過程有一定的影響, 并且其作用效果在不同的H2O2濃度和不同時間下是不同的。我們發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素MC-LR可緩解250 μmol/L H2O2引起的藻細(xì)胞損傷并增強(qiáng)微囊藻自身的生存能力。

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