郭 慧 周乃珍 趙 帥 王 琛 朱紅年 張盛周

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 蕪湖 241000)

消化道內(nèi)分泌細(xì)胞散在分布于消化道黏膜中, 其分泌的多種胃腸激素具有調(diào)節(jié)消化吸收過(guò)程、保護(hù)胃腸黏膜和控制動(dòng)物攝食行為等多項(xiàng)生理作用[1,2]。目前, 對(duì)脊椎動(dòng)物消化道內(nèi)分泌細(xì)胞已進(jìn)行了廣泛而深入的研究, 發(fā)現(xiàn)了 30多種類(lèi)型的內(nèi)分泌細(xì)胞[1]。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)兩棲動(dòng)物消化道內(nèi)分泌細(xì)胞進(jìn)行研究, 也有不少報(bào)道, 共檢測(cè)到了 10多種內(nèi)分泌細(xì)胞[3—8]。研究表明[9—12],動(dòng)物消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的種類(lèi)和分布型是長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中對(duì)特殊食性適應(yīng)的結(jié)果, 同時(shí)受諸如食物成分、環(huán)境條件和病理變化等多種因素的影響。

無(wú)尾兩棲動(dòng)物變態(tài)前后食性和消化機(jī)能發(fā)生了較大的變化, 消化器官亦發(fā)生復(fù)雜的重塑[13,14], 有關(guān)這一重塑過(guò)程中消化道的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)變化有不少報(bào)道, 但這些研究主要集中在對(duì)消化道上皮細(xì)胞的凋亡和消化道各組織層的變化方面[13,14], 對(duì)消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的變化研究較少[15—18]。牛蛙(Rana catesbeiana)隸屬兩棲綱無(wú)尾目, 是一種大型蛙, 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高, 自 1959年我國(guó)從古巴引進(jìn)牛蛙以來(lái), 已在 20多個(gè)省(區(qū))進(jìn)行人工養(yǎng)殖或野生放養(yǎng)。我們?cè)鴮?duì)其成體消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的分布進(jìn)行了研究[3], 其變態(tài)發(fā)育前后消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的變化尚未見(jiàn)報(bào)道。本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)牛蛙變態(tài)發(fā)育前后消化道 5-羥色胺(5-HT)、生長(zhǎng)抑素(SS)、胃泌素(GAS)、胰高血糖素(GLU)和胰多肽(PP)免疫陽(yáng)性(IR)細(xì)胞的分布密度、組織定位和形態(tài)的變化進(jìn)行了研究, 旨在增進(jìn)對(duì)兩棲動(dòng)物變態(tài)發(fā)育過(guò)程中消化道內(nèi)分泌細(xì)胞演變規(guī)律的認(rèn)識(shí)。同時(shí), 為研究不同發(fā)育階段牛蛙的消化機(jī)能積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛蛙蝌蚪取自蕪湖市南陵縣仙坊鎮(zhèn)牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng), 參照L'Hermit,et al.[15]的方法, 根據(jù)附肢的發(fā)育及尾部的變化情況,分成三個(gè)變態(tài)發(fā)育階段： (1)變態(tài)前期(Prometamorphosis stage, Pro-MS)： 后肢發(fā)育完全, 前肢芽開(kāi)始出現(xiàn); (2)變態(tài)高峰期(Metamorphic climax stage, MCS)： 四肢發(fā)育完全, 尾部開(kāi)始消退; (3)變態(tài)后期(Postmetamorphosis stage, Post-MS)： 變態(tài)完成, 開(kāi)始捕食, 胃中有食物。每個(gè)發(fā)育階段取材6只。

分別取出變態(tài)前期、變態(tài)高峰期和變態(tài)后期蝌蚪的完整消化道, 按消化道不同部位取材： 食管、賁門(mén)、胃體、幽門(mén)、腸前段、腸中段、腸后段。生理鹽水洗凈, 立即放入無(wú)冰醋酸的 Bouin’s液固定 24—48h, 常規(guī)脫水透明,石蠟包埋, 切片, 厚6 μm, 貼片。

1.2 主要試劑

5種胃腸激素抗血清(表 1)。鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(Streptavidin peroxidase, S-P)免疫組織化學(xué)試劑盒(SP-9001)購(gòu)于北京中山生物技術(shù)公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法

常規(guī)石蠟切片脫蠟至水, 3% H2O2甲醇溶液孵育15min, 消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。蒸餾水浸洗, PBS浸泡 5min, 滴加正常山羊血清(1∶10)室溫孵育 10min, 封閉非特異性反應(yīng)部位。傾去血清, 滴加一抗, 4℃過(guò)夜。PBS浸洗5min×3次, 滴加即用型生物素標(biāo)記的二抗(均為羊抗兔IgG抗血清), 室溫孵育1.5h。PBS浸洗5min×3次,滴加即用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶, 室溫孵育1h。PBS浸洗5min×3次, DAB-H2O2顯色, 蘇木精復(fù)染, 自來(lái)水洗凈。脫水、透明、封片。免疫組織化學(xué)陰性對(duì)照, 分別用正常山羊血清和PBS代替一抗, 其余步驟同上。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

在奧林巴斯 BX61型顯微鏡下觀察拍照, 并對(duì)每個(gè)部位的切片隨即取10個(gè)400倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù), 取平均值(±SD), 表示內(nèi)分泌細(xì)胞的分布密度, 并用數(shù)據(jù)處理軟件SPSS 11.5對(duì)內(nèi)分泌細(xì)胞的密度變化情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)P<0.05時(shí)差異顯著,P<0.01時(shí)差異非常顯著, 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在光鏡下, 經(jīng)染色的切片背景呈淡藍(lán)色, 免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色或深棕色, 核淡藍(lán)色或被遮住。陰性對(duì)照切片呈淡藍(lán)色, 未見(jiàn)免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞。5種內(nèi)分泌細(xì)胞在變態(tài)發(fā)育前后牛蛙消化道各部位的分布密度及其變化(表2)。

表1 胃腸激素抗血清一覽表Tab.1 Details of the gut hormone antisera

表2 牛蛙變態(tài)發(fā)育前后消化道內(nèi)分泌細(xì)胞分布密度的變化Tab.2 Distribution density of endocrine cells in the digestive tract in Rana catesbeiana during metamorphosis (cells/400× field, mean±SD)

2.1 5-HT-IR細(xì)胞

5-HT-IR細(xì)胞在變態(tài)前期已出現(xiàn), 消化道各段均有分布, 且各段分布密度無(wú)顯著性差異。變態(tài)高峰期和變態(tài)后期, 5-HT-IR細(xì)胞亦在消化道各段均有分布, 但賁門(mén)和前腸 5-HT-IR細(xì)胞密度顯著增加(P<0.01), 變態(tài)后期, 前腸 5-HT-IR細(xì)胞密度繼續(xù)顯著增加(P<0.01)。變態(tài)前期,消化道各段黏膜上皮均為單層柱狀上皮, 5-HT-IR細(xì)胞主要位于上皮細(xì)胞之間, 少數(shù)位于上皮基部, 細(xì)胞染色深,多數(shù)細(xì)胞具有胞突, 且胞突較長(zhǎng)(圖版Ⅰ-1、2)。變態(tài)高峰期, 消化道各段黏膜上皮均為單層柱狀上皮, 胃 5-HT-IR細(xì)胞位于上皮基部或胃腺固有層中, 食管和腸道5-HT-IR細(xì)胞主要位于上皮細(xì)胞之間。細(xì)胞中心的陽(yáng)性反應(yīng)明顯較弱, 多數(shù)細(xì)胞沒(méi)有胞突, 少數(shù)細(xì)胞有較短的胞突(圖版Ⅰ-3、4)。變態(tài)后期, 食管黏膜上皮為假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮, 胃和腸道黏膜上皮為單層柱狀上皮, 胃5-HT-IR細(xì)胞主要位于胃腺部, 上皮中偶見(jiàn), 食管和腸道5-HT-IR細(xì)胞主要位于黏膜上皮細(xì)胞之間, 少數(shù)位于上皮基部。細(xì)胞染色變深, 多數(shù)細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)胞突, 胞突較變態(tài)前期短(圖版Ⅰ-5、6)。

2.2 SS-IR細(xì)胞

SS-IR細(xì)胞在變態(tài)前期已出現(xiàn), 消化道各段均有分布, 且各段分布密度無(wú)顯著性差異。變態(tài)高峰期和變態(tài)后期, SS-IR細(xì)胞在除食管外的消化道各段均有分布, 且賁門(mén)、胃體和腸前段SS-IR細(xì)胞密度顯著增加(P<0.01)。變態(tài)前期, SS-IR細(xì)胞主要位于上皮細(xì)胞之間, 固有層中偶見(jiàn), 食管和胃部的 SS-IR細(xì)胞幾乎都是錐形和梭形結(jié)構(gòu),有較長(zhǎng)胞突(圖版Ⅰ-7); 腸道 SS-IR細(xì)胞呈圓形和錐形。陽(yáng)性細(xì)胞染色深。變態(tài)高峰期, 胃SS-IR細(xì)胞位于胃腺部,腺上皮細(xì)胞外圍; 腸道SS-IR細(xì)胞位于上皮基部。陽(yáng)性細(xì)胞胞突消失, 染色較淺(圖版Ⅰ-8)。變態(tài)后期, 胃 SS-IR細(xì)胞位于胃腺部, 多數(shù)細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)較短的胞突, 伸向鄰近細(xì)胞或細(xì)胞間隙(圖版Ⅰ-9); 腸道 SS-IR細(xì)胞位于上皮基部, 呈圓形。陽(yáng)性細(xì)胞染色較深。

2.3 GAS-IR細(xì)胞

GAS-IR細(xì)胞從變態(tài)高峰期才開(kāi)始出現(xiàn), 始于腸前段。變態(tài)后期, 分布于賁門(mén)、幽門(mén)、腸前段和腸中段, 以腸中段密度最高, 且腸前段 GAS-IR細(xì)胞密度顯著減少(P<0.01)。變態(tài)高峰期, GAS-IR細(xì)胞位于上皮細(xì)胞之間和固有層中, 呈圓形, 細(xì)胞染色較淺(圖版Ⅰ-10)。變態(tài)后期,賁門(mén)和幽門(mén)的GAS-IR細(xì)胞主要位于胃腺固有層中, 呈圓形、橢圓形(圖版Ⅰ-11), 腸前段和腸中段的GAS-IR細(xì)胞主要位于上皮基部, 呈圓形(圖版Ⅰ-12)。陽(yáng)性細(xì)胞染色較深。

2.4 GLU-IR細(xì)胞

GLU-IR細(xì)胞在變態(tài)前期已出現(xiàn)。變態(tài)前期, GLU-IR細(xì)胞分布于除腸前段以外的消化道各段, 且分布密度無(wú)顯著性差異。變態(tài)高峰期, GLU-IR細(xì)胞分布于食管、賁門(mén)、胃體和腸后段。變態(tài)后期, GLU-IR細(xì)胞分布于除腸前段和腸中段以外的消化道各段。變態(tài)高峰期, 賁門(mén)、胃體和腸后段的GLU-IR細(xì)胞密度顯著增加(P<0.05)。變態(tài)前期, GLU-IR細(xì)胞位于上皮細(xì)胞之間, 食管和胃GLU-IR細(xì)胞呈圓形或梭形, 其一端具有較長(zhǎng)的胞突伸向消化道腔(圖版Ⅰ-13); 腸道GLU-IR細(xì)胞呈圓形。陽(yáng)性細(xì)胞染色較深。變態(tài)高峰期, 食管和腸道GLU-IR細(xì)胞位于上皮基部, 胃GLU-IR細(xì)胞位于胃腺部, 腺泡上皮細(xì)胞外圍。陽(yáng)性細(xì)胞胞突消失, 染色較淺(圖版Ⅰ-14)。變態(tài)后期, 食管和腸道GLU-IR細(xì)胞位于上皮基部, 呈圓形。胃GLU-IR細(xì)胞位于胃腺部, 多數(shù)細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)胞突, 胞突較變態(tài)前期短。陽(yáng)性細(xì)胞染色較深(圖版Ⅰ-15)。

2.5 PP-IR細(xì)胞

PP-IR細(xì)胞在牛蛙變態(tài)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期消化道中均未檢測(cè)出。

3 討論

5-HT、SS、GAS、GLU和PP-IR細(xì)胞等屬脊椎動(dòng)物消化道內(nèi) 5種重要胃腸激素內(nèi)分泌細(xì)胞, 我們?cè)鴮?duì)其在成體牛蛙消化道中的存在與分布作了鑒定和定位[3], 本研究顯示這些內(nèi)分泌細(xì)胞的分布密度和形態(tài)在變態(tài)發(fā)育前后發(fā)生了明顯的變化。

3.1 內(nèi)分泌細(xì)胞分布密度的變化

5-HT、SS、GAS和GLU-IR細(xì)胞廣泛分布于各類(lèi)兩棲動(dòng)物成體消化道中[3—8]。Bodegas,et al.[16]和 Villaro,et al.[17]分別在變態(tài)前期蛙蝌蚪前腸和胃中檢測(cè)到了5-HT、SS和GLU-IR細(xì)胞。Maake,et al.[18]在非洲爪蟾(Xenopus laeuis)變態(tài)發(fā)育前期消化道檢測(cè)到 SS和 GLU-IR細(xì)胞,本研究在牛蛙變態(tài)發(fā)育前期消化道中檢測(cè)出5-HT、SS和GLU-IR細(xì)胞, 可見(jiàn), 5-HT、SS和GLU-IR細(xì)胞在兩棲動(dòng)物消化道發(fā)育中出現(xiàn)較早。GAS-IR細(xì)胞在牛蛙變態(tài)高峰期才出現(xiàn), 潘紅珍等[19]研究中華蟾蜍(Bufo gargarizans)變態(tài)發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn), GAS-IR細(xì)胞在幼蟾期才出現(xiàn), Villaro,et al.[17]在變態(tài)前期時(shí)蛙(Rana temporaria)胃中未檢測(cè)到GAS-IR細(xì)胞, 可見(jiàn), GAS-IR細(xì)胞在兩棲動(dòng)物消化道發(fā)育中出現(xiàn)較遲且出現(xiàn)的時(shí)期存在種間差異。PP-IR細(xì)胞在兩棲類(lèi)消化道的分布有較大種間差異, 不同的研究者分別在棘胸蛙(Paa spinosa)[4]、紅腹鈴蟾(Bombina bombina)[5]和豹蟾(Bufo regularis)[6]消化道中檢出了 PP-IR細(xì)胞, 而黃徐根等[7]在日本林蛙(Rana japonica japonica)消化道未檢測(cè)到PP-IR細(xì)胞, Buchan[8]在其研究的各類(lèi)兩棲動(dòng)物消化道中均未發(fā)現(xiàn)PP-IR細(xì)胞, 張盛周等[3]在牛蛙消化道亦未發(fā)現(xiàn)PP-IR細(xì)胞。本研究在牛蛙變態(tài)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均未檢測(cè)到PP-IR細(xì)胞, 顯示PP-IR細(xì)胞在牛蛙消化道中可能無(wú)組織發(fā)生。

Maake,et al.[18]研究發(fā)現(xiàn)非洲爪蟾消化道 SS和GLU-IR細(xì)胞的分布密度隨著變態(tài)發(fā)育的進(jìn)行而逐漸增加,本研究表明牛蛙消化道SS和GLU-IR細(xì)胞在變態(tài)高峰期后顯著增多, 與非洲爪蟾相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)變態(tài)前期,5-HT、SS和GLU-IR細(xì)胞在消化道各段分布密度無(wú)顯著性差異, 變態(tài)高峰期, 3種內(nèi)分泌細(xì)胞的分布型發(fā)生了明顯變化, 變態(tài)高峰期之后內(nèi)分泌細(xì)胞的分布型與牛蛙成體基本一致[3], GAS-IR細(xì)胞在變態(tài)高峰期開(kāi)始出現(xiàn)?？梢?jiàn), 牛蛙消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的分布型在變態(tài)高峰期發(fā)生了重塑。

對(duì)哺乳動(dòng)物的研究表明, 改變食物組成成分可以影響消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的分布型[10], 動(dòng)物消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的分布型可能是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中對(duì)特殊食性適應(yīng)的結(jié)果[12]。我們通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道的不同食性動(dòng)物消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的分布型比較發(fā)現(xiàn), 變態(tài)前期, 牛蛙消化道5-HT-IR 細(xì)胞的分布型與雜食性中國(guó)對(duì)蝦(Penaeus chinensis)[20]和鯔魚(yú)(Mugil cephalus)[21]相似, SS-IR細(xì)胞的分布與雜食性的鯔魚(yú)[21]相似, GLU-IR細(xì)胞的分布與草食性魚(yú)類(lèi)相似[22]。變態(tài)后期, 牛蛙消化道SS-IR細(xì)胞的分布與肉食性的日本鰻鱺(Anguilla japonicus)[23]相似。GAS-IR細(xì)胞的分布與肉食性的日本鰻鱺[23]、黑鯛(Sparus macrocephalus)[24]、花鱸(Lateolabrax japonicus)[25]相似。牛蛙變態(tài)發(fā)育過(guò)程中食性會(huì)發(fā)生明顯變化, 變態(tài)前期, 蝌蚪以浮游植物和浮游動(dòng)物為食, 屬植食性或雜食性; 變態(tài)高峰期, 停止進(jìn)食; 變態(tài)后期, 幼蛙主要以昆蟲(chóng)、蚯蚓、田螺、蟹、小魚(yú)、小蝦等為食, 屬肉食性?？梢?jiàn), 牛蛙變態(tài)發(fā)育前后消化道內(nèi)分泌細(xì)胞分布型的變化與其食性改變是相適應(yīng)的。

3.2 內(nèi)分泌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征, 現(xiàn)一般將消化道內(nèi)分泌細(xì)胞分為開(kāi)放型和閉合型兩大類(lèi)[2]。開(kāi)放型內(nèi)分泌細(xì)胞有較長(zhǎng)的細(xì)胞質(zhì)突起伸向消化腔, 可感受消化腔內(nèi)容物的刺激而分泌; 閉合型內(nèi)分泌細(xì)胞沒(méi)有胞突, 與消化腔無(wú)直接聯(lián)系, 主要感受局部組織內(nèi)環(huán)境變化的刺激而分泌。本研究顯示牛蛙消化道5-HT、SS和GLU-IR細(xì)胞多為開(kāi)放型,GAS-IR細(xì)胞則多屬閉合型。本研究還發(fā)現(xiàn)變態(tài)前期內(nèi)分泌細(xì)胞胞突較長(zhǎng), 細(xì)胞染色較深; 變態(tài)高峰期, 多數(shù)細(xì)胞沒(méi)有胞突或有較短的胞突, 細(xì)胞染色較淺; 變態(tài)后期, 多數(shù)細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)胞突, 細(xì)胞染色較深。變態(tài)前期, 蝌蚪正常進(jìn)食, 內(nèi)分泌細(xì)胞可通過(guò)胞突感受消化腔內(nèi)容物刺激而合成較多分泌物; 變態(tài)高峰期, 蝌蚪停止進(jìn)食, 內(nèi)分泌細(xì)胞功能活動(dòng)降低; 變態(tài)后期, 幼蛙恢復(fù)進(jìn)食, 內(nèi)分泌細(xì)胞開(kāi)始恢復(fù)行使其功能?？梢?jiàn), 不同發(fā)育時(shí)期, 牛蛙消化道內(nèi)分泌細(xì)胞形態(tài)變化與其消化生理狀態(tài)是相適應(yīng)的。

圖版Ⅰ PlateⅠ

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