孫 雪 蔡西栗 徐年軍

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 浙江省海洋生物工程重點實驗室, 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點實驗室, 寧波 315211)

龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)是紅藻門、江蘺屬海藻, 主要用于生產(chǎn)瓊膠和飼喂鮑魚, 能有效改善海洋生態(tài)環(huán)境, 具有一定的社會效益[1]。隨著海藻膠工業(yè)的發(fā)展, 對瓊膠生產(chǎn)原料藻的需求也日益增加。目前, 龍須菜在我國已經(jīng)成為繼海帶(Laminaria)、紫菜(Porphyra)、裙帶菜(Undaria)之后的第4大栽培海藻[2]。野生龍須菜主要生長在北方, 經(jīng)過改良的龍須菜 981品系在 12—26℃生長較好, 目前已經(jīng)在我國廣東、福建、浙江、山東、遼寧等沿海地區(qū)大面積養(yǎng)殖, 其生長快, 養(yǎng)殖技術(shù)成熟, 帶動了一個大型海藻的新興產(chǎn)業(yè)鏈。

溫度是影響海藻生長的主要生態(tài)因子, 是造成海藻色素、蛋白質(zhì)和糖類等生化組分變化的主要因素[3]。龍須菜最適生長季節(jié)是春季和秋季, 在夏季氣溫較高時生長緩慢, 持續(xù)高溫可使藻體嚴重損傷, 生長期縮短, 造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降。而在冬季海水溫度過低, 龍須菜生長速度非常緩慢。因此對龍須菜高溫和低溫逆境下的生理研究具有重要意義。本文探討了這兩種溫度脅迫下龍須菜生長、細胞超微結(jié)構(gòu)、抗氧化酶、過氧化產(chǎn)物、光合色素、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及植物激素的短期應(yīng)激響應(yīng)規(guī)律, 為系統(tǒng)研究龍須菜在溫度脅迫下的應(yīng)激調(diào)控機制提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

龍須菜(G.lemaneiformis)981于2010年9月采于福建寧德海藻養(yǎng)殖場(26o36′N, 119o42′E), 在實驗室保種培養(yǎng)1個月左右。實驗前于25℃預(yù)培養(yǎng)1周。實驗在光照培養(yǎng)箱中進行, Provasoli培養(yǎng)基[4], 光照強度60 μmol/(m2·s),光周期 L∶D(12h∶12h), 鹽度 25‰。分別設(shè)置低溫脅迫組(15℃)、高溫脅迫組(33℃)和對照組(25℃), 每組3個平行。分別于培養(yǎng)0、1、3、6、10、24、48、72h取樣, 蒸餾水快速沖洗后吸干水分, 液氮快速處理后于?20℃保存,冷凍干燥備用。

吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)、肉桂酸(RA)、脯氨酸、甜菜堿標準品和三甲基硅烷基重氮甲烷正己烷溶液均購自Sigma公司; 脫落酸(ABA)、二氫茉莉酸(dhJA)購自東京化成工業(yè)株式會社; 甲醇、正己烷為色譜純; 其余試劑為分析純。

1.2 實驗方法

相對生長速率的測定 通過測定龍須菜實驗前后藻體鮮質(zhì)量的變化, 計算相對生長速率(RGR)[5].

式中：W0為實驗開始時藻的鮮質(zhì)量(g);Wt為實驗結(jié)束時藻的鮮質(zhì)量(g);t為實驗天數(shù)。

細胞超微結(jié)構(gòu)的觀察 龍須菜藻體用 3%戊二醛固定, 0.1 mol/L PBS緩沖液沖洗后用1%鋨酸固定, 再用PBS緩沖液沖洗, 經(jīng)系列丙酮脫水、滲透、包埋、超薄切片, 最后用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色, 在日立H-7650型透射電鏡(TEM)觀察。

SOD、POD和MDA檢測 準確稱取樣品0.1 g, 液氮研磨后加0.1 mol/L PBS 緩沖液(pH 7.8)10 mL, 7000 r/min離心10min, 取上清液。SOD活力測定采用氮藍四唑(NBT)法, POD活力測定采用愈創(chuàng)木酚法, MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[6]。

光合色素的含量檢測 藻紅蛋白(R-PE)、藻藍蛋白(R-PC)和葉綠素a含量測定參考朱招波等的方法[7]： 藻紅蛋白和藻藍蛋白測定取龍須菜0.1 g, 液氮研磨后PBS緩沖液提取, 分光光度計測定。葉綠素a含量測定另取龍須菜0.1 g液氮研磨后, 80%丙酮提取, 分光光度法測定其含量。

滲透調(diào)節(jié)物的含量測定 脯氨酸和甘露醇含量測定參照朱招波等的方法[7]： 游離脯氨酸采用磺基水楊酸反應(yīng)后酸性茚三酮顯色法測定。甘露醇含量采用硫酸銅比色法測定。

植物激素的含量測定 5種植物激素含量測定參照蔡西栗等的方法[8]。0.2 g龍須菜液氮研磨后加入含BHT 100 mg/L的正丙醇∶水∶HCl(2∶1∶0.002)提取, 提取物固相萃取柱純化, 甲醇洗脫, 三甲基硅烷化重氮甲烷正己烷溶液衍生化, 水浴反應(yīng)后氮氣吹干, GC-MS分析。

植物激素含量計算采用公式： 植物激素含量(ng/g)=(A激素/A內(nèi)標/a×M)/W。其中A為峰面積,a為標準曲線的斜率,M為內(nèi)標加入量,W為樣品重。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel 2003、Origin 8.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 逆境溫度對龍須菜相對生長速率的影響

圖1可見, 龍須菜在低溫和高溫下生長均受到抑制,高溫對生長的影響更明顯。低溫脅迫龍須菜的相對生長速率是4.58%/d, 為對照組的72.93%; 在高溫脅迫下龍須菜的相對生長速率是2.43%/d, 為對照組的38.69%。龍須菜在高溫和低溫脅迫下, 藻體均表現(xiàn)出分枝減少, 顏色變淺等癥狀, 在高溫脅迫下龍須菜還出現(xiàn)了根尖變白、易碎等癥狀, 部分藻體死亡。

2.2 逆境溫度對龍須菜細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖1 逆境溫度對龍須菜相對生長速率的影響Fig.1 Effects of adverse temperature on the relative growth rate(RGR) of G.lemaneiformis

由圖 2可見, 對照組龍須菜的細胞壁結(jié)構(gòu)完整, 層次分明(圖2b); 色素體板層狀結(jié)構(gòu)清晰, 層次分明(圖2e);細胞內(nèi)紅藻淀粉顆粒較少, 細胞間孔狀聯(lián)系結(jié)構(gòu)清晰、完整(圖 2h)。低溫脅迫組龍須菜的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生了褶皺,層次模糊, 且周圍有少量紅藻淀粉顆粒附著(圖2a); 細胞內(nèi)出現(xiàn)較多的紅藻淀粉顆粒, 色素體板層結(jié)構(gòu)較為模糊,有明顯的腫脹現(xiàn)象(圖2d); 但細胞間孔狀聯(lián)系仍清晰、完整(圖2g)。高溫脅迫組龍須菜細胞壁結(jié)構(gòu)較為完整, 但層次模糊難辨(圖2c), 細胞內(nèi)出現(xiàn)大量的紅藻淀粉顆粒, 色素體板層狀結(jié)構(gòu)較為完整(圖2f), 細胞間孔狀聯(lián)系扭曲變形(圖 2i)。

2.3 逆境溫度對龍須菜SOD、POD、MDA的影響

由圖3可見, 對照組龍須菜SOD、POD活性和MDA含量均較穩(wěn)定。SOD活性維持在529.27—608.73 U/g, POD活性維持在337.52—377.56 U/g。在低溫脅迫下龍須菜的SOD活性比對照組略低, 72h時最終活性為對照組的81.74%。POD活性先下降后上升, 最終活性與對照組無顯著差異。MDA含量前期略有升高, 6h之后恢復(fù)到正常水平。在高溫脅迫下龍須菜SOD活性比對照組顯著降低,72h時下降到了 342.26 U/g, 為對照組的 56.23%。POD活性有所上升, 72h時達到705.42 U/g, 比對照組高出95.8%。MDA含量有較明顯的升高, 72h時達到124.41 μmol/g, 比對照組高89.0%。

2.4 逆境溫度對龍須菜光合色素的影響

由圖 4可見, 對照組龍須菜藻紅蛋白、藻藍蛋白和葉綠素a含量在培養(yǎng)前48h均較為穩(wěn)定, 48h后均略有下降, 這可能是培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽含量減少所致。紅藻光合色素含量與介質(zhì)氮濃度密切相關(guān), 氮濃度高時, 藻體內(nèi)光合色素含量也高; 缺氮時光合色素含量降低[9]。在低溫和高溫脅迫下龍須菜光合色素均有一定程度的下降, 在低溫脅迫下藻紅蛋白、藻藍蛋白和葉綠素a含量開始迅速下降, 最終含量為對照組的74.79%、74.88%和73.86%。在高溫脅迫下龍須菜3種光合色素在48h與低溫脅迫組基本相同, 但72h時進一步下降到對照組的45.33%、59.02%和50.12%?？梢姼邷貙堩毑松氐钠茐淖饔帽容^強。

2.5 逆境溫度對龍須菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

圖2 逆境溫度對龍須菜細胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of adverse temperature on the ultrastructure of G.lemaneiformis cells by TEM

由圖 5可見, 對照組龍須菜體內(nèi)脯氨酸和甘露醇含量相對較穩(wěn)定。在低溫脅迫下龍須菜的脯氨酸含量隨著脅迫時間的延長緩慢增加, 72h時比對照組增加了44.99%。在高溫脅迫下龍須菜脯氨酸含量增加更快, 72h比對照組高出了 69.78%。在低溫脅迫下甘露醇含量與對照組差異不顯著(P>0.05)。在高溫脅迫下甘露醇含量在72 h時達到108.23 mg/g, 比對照組高34.47%。

2.6 逆境溫度對龍須菜植物激素的影響

由圖6可見, 對照組龍須菜中IAA含量變化不顯著,其他 4種植物激素在實驗過程中均有所上升, 這可能是龍須菜在生長過程中受到營養(yǎng)等條件變化所致。在兩種溫度脅迫下龍須菜 IAA都有所降低, 但高溫脅迫對龍須菜IAA影響較大, 72h時比對照組下降了39.75%, 而低溫脅迫下龍須菜IAA含量降低不明顯。其他4種植物激素在這 2種溫度脅迫下均有所升高, 并且呈先上升后下降的在10h和6h達到最大值, 在高溫下SA含量的變化更快。在低溫和高溫脅迫下RA含量比對照組高, 到10h達到最大值, 隨后又緩慢下降。

圖3 逆境溫度對龍須菜SOD、POD活性和MDA含量的影響Fig.3 Effects of adverse temperature on the SOD, POD activities and MDA content of G.lemaneiformis

圖4 逆境溫度對龍須菜藻紅蛋白、藻藍蛋白和葉綠素a含量的影響Fig.4 Effects of adverse temperature on the contents of phycoerythrin, phycocyanin and chlorophyll a of G.lemaneiformis

圖5 逆境溫度對龍須菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和甘露醇含量的影響Fig.5 Effects of adverse temperature on the proline and mannitol content of G.lemaneiformis

3 討論

3.1 溫度脅迫對龍須菜生長速率、超微結(jié)構(gòu)和抗氧化系統(tǒng)的影響

圖6 逆境溫度對龍須菜植物激素(吲哚乙酸、脫落酸、茉莉酸、水楊酸、肉桂酸)含量的影響Fig.6 Effects of adverse temperature on the phytohormone (IAA,ABA, JA, SA, RA) content of G.lemaneiformis

植物的生長受溫度、光照、營養(yǎng)等多種環(huán)境因子的影響, 其中溫度主要影響代謝酶的活性和代謝速度。在低溫脅迫下龍須菜的酶活受到一定影響, 但在 15℃條件下龍須菜仍然能夠適應(yīng)。在高溫脅迫下龍須菜抗氧化酶活性受到抑制, 破壞了細胞結(jié)構(gòu), 所以其生長受抑制程度要高于低溫組。余江[10]研究發(fā)現(xiàn)龍須菜(G.lemaneiformis)在30℃、鹽度22‰、光照5000 1x時藻體細胞出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離、類囊體膨脹變形、嗜鋨顆粒沉積、線粒體部分溶解等特征, 生長受到明顯抑制。本實驗發(fā)現(xiàn)在溫度脅迫下龍須菜細胞壁和色素體結(jié)構(gòu)受到不同程度的損傷,細胞內(nèi)紅藻淀粉顆粒大量積累, 這可能是細胞自我保護的一種機制。

植物體內(nèi)SOD可以消除超氧化物自由基并將其轉(zhuǎn)變成H2O2, 而POD可以將H2O2轉(zhuǎn)變成H2O和O2, 從而徹底消除超氧化物自由基, 它們的活性對環(huán)境變化非常敏感。在本實驗中低溫脅迫下龍須菜SOD、POD、MDA與對照組相比差別不大, 在高溫脅迫下龍須菜 SOD活性在前期有所提高, 后期顯著下降; POD活性和MDA含量在脅迫后期顯著上升。這一結(jié)果與柯德森等的結(jié)果相似[11],他們報道當溫度低于25℃時龍須菜POD活性隨培養(yǎng)時間變化并不明顯, 但在30℃或35℃條件下12d內(nèi)POD活性上升了近5倍。

3.2 溫度脅迫對龍須菜光合色素和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

龍須菜的光合色素主要有藻紅蛋白(R-PE)、藻藍蛋白(R-PC)、別藻藍蛋白(APC)和葉綠素, 其含量容易受環(huán)境因素的影響[12]。在高溫脅迫下江蘺(Gracilariasp.)中藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白和葉綠素比例發(fā)生了變化,藻體的顏色就會發(fā)生相應(yīng)的變化。在本實驗中龍須菜在低溫和高溫脅迫下顏色變淺, 可能是由于藻紅蛋白、藻藍蛋白和葉綠素a含量下降所引起的, 對這3種光合色素的含量檢測結(jié)果驗證了這一點。

植物體內(nèi)脯氨酸、甘露醇不僅對細胞滲透壓起調(diào)節(jié)作用, 還對活性氧特別是 O2-和·OH 的產(chǎn)生有抑制作用,對·OH有清除作用, 表明滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累對植物抗逆性有雙重作用。Chang,et al.[13]研究發(fā)現(xiàn)細基江蘺繁枝變種(G.tenuistipitatavar.liui)在35℃條件下脯氨酸含量第2天開始逐漸增加, 第7天后由于藻體的部分死亡含量開始下降。在本實驗中低溫脅迫下龍須菜脯氨酸含量升高,而甘露醇含量沒有顯著變化。在高溫脅迫下脯氨酸和甘露醇都有一定程度的升高, 表明溫度脅迫造成了龍須菜滲透壓的改變, 其中脯氨酸在滲透調(diào)節(jié)中作用較大。

3.3 溫度脅迫對龍須菜內(nèi)源植物激素的影響

植物受到逆境脅迫時, 體內(nèi)的植物激素會發(fā)生應(yīng)激性變化, 從而激活體內(nèi)的信息傳遞系統(tǒng), 產(chǎn)生抵御逆境脅迫的生理活性物質(zhì)。如逆境脅迫條件下植物啟動脫落酸(ABA)合成系統(tǒng), 合成更多的 ABA, 調(diào)節(jié)體內(nèi)的水分代謝, 控制呼吸作用, 增強植株抵抗能力[14]。在植物體內(nèi)的水楊酸信號通路中, SA主要通過誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化使逆境蛋白表達從而獲得抗性, JA也作為內(nèi)源信號分子參與生物因子和非生物因子逆境脅迫的信號傳遞。樊揚等[15]發(fā)現(xiàn)龍須菜愈傷組織分化過程中內(nèi)源激素 iPAs、GA、IAA和ABA含量發(fā)生改變, 尤其是ABA的積累與高等植物在逆境脅迫中表現(xiàn)相同。本實驗結(jié)果顯示低溫對龍須菜IAA影響不顯著, 而高溫脅迫下 IAA一直處于較低水平, 表明高溫脅迫可能抑制了 IAA的產(chǎn)生, 因而對龍須菜的生長影響較大。在2種溫度脅迫下ABA含量均有所升高, 在高溫脅迫下ABA變化更大, 表明高溫更能刺激龍須菜在短時間內(nèi)對脅迫做出應(yīng)激反應(yīng), 以減少逆境對藻體的傷害。低溫脅迫下龍須菜JA含量變化不大, 高溫脅迫下JA含量一直處于較高水平, 表明高溫脅迫導(dǎo)致的傷害更大。SA和RA的變化趨勢一致, 可能是因為SA合成的途徑之一就是由反式肉桂酸的側(cè)鏈 β氧化生成, 在兩種脅迫前期SA和RA含量高于對照組, 后期呈現(xiàn)下降趨勢。

龍須菜對溫度脅迫比較敏感, 特別是高溫對龍須菜的生理影響更大。溫度脅迫導(dǎo)致光合色素蛋白變性, 細胞內(nèi)抗氧化酶等酶活受到影響, 從而影響細胞滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng), 最終造成細胞結(jié)構(gòu)破壞, 生長減慢甚至逐漸死亡。同時還可以通過內(nèi)源性植物激素的快速響應(yīng)調(diào)節(jié)緩解藻體的抗逆生理。

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