周燕芳

（韓山師范學(xué)院化學(xué)系，廣東潮州 521041）

胡子鯰，俗稱塘鲺，在分類上屬鯉形目、胡子鯰科，屬于熱帶、亞熱帶魚類，廣布于我國南方各地，既是營養(yǎng)豐富的消費(fèi)品，同時(shí)具有較好的藥用及滋補(bǔ)作用[1]。胡子鯰適應(yīng)能力強(qiáng)，容易養(yǎng)殖，成本較低，是重要淡水魚類養(yǎng)殖對象。一般只作為人們餐桌的食用魚類之一，本試驗(yàn)根據(jù)胡子鯰魚類的易養(yǎng)殖、產(chǎn)量大的特點(diǎn)，結(jié)合多肽、氨基酸等具有生物活性物質(zhì)（如對鳙魚[2]、鰻魚[3]、雞肉[4]等的研究）的開發(fā)前景，對胡子鯰魚蛋白酶水解條件進(jìn)行研究，通過對木瓜蛋白酶水解胡子鯰的水解條件的研究，目的是找出最佳的水解途徑，以便為胡子鯰功能食品開發(fā)和利用做一些探索性研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料及主要儀器、設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑

胡子鯰：購于潮州市橋東市場；

木瓜蛋白酶（酶活力6 000 U/mg），其它試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

501 超級恒溫槽：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；800 型離心機(jī)：上海手術(shù)器械廠；FA2004N 電子天平：上海精科；數(shù)顯精密pH 計(jì)；微量凱氏定氮儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程[5]

新鮮胡子鯰→蒸熟、壓榨（去脂肪）→65 ℃烘干、搗碎的魚粉（備用）→稱量→加水稀釋→調(diào)pH→加溫酶水解→滅酶（100 ℃，10 min）→冷卻→離心（15 min）→收集上清液，定容至50 mL→分析

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 氨基態(tài)氮含量的測定

采用雙指示劑甲醛滴定法[6]。

取兩個(gè)干凈的三角瓶，各吸取10 mL 酶水解液，第一個(gè)瓶中加入5 mL 甲醛和3 滴酚酞，搖勻、靜置1 min后，用0.01 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)液滴定，消耗體積為V1；第二個(gè)瓶中加入3 滴中性紅指示劑，搖勻、靜置1 min后，用0.01 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)液滴定，消耗體積為V2。按下式計(jì)算胡子鯰酶水解液中氨基態(tài)氮含量：氨基態(tài)氮含量/（mg/L）=c×（V1-V2）×10×0.014×1000/0.01L，式中：c 為NaOH 標(biāo)準(zhǔn)液濃度，（mol/L）。

1.2.2.2 原料總氮量的測定

微量凱氏定氮法[7]。

1.2.2.3 水解度的測定

水解液中游離氨基態(tài)氮含量/原料總氮含量×100%[8]。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)[9]

酶用量、底物濃度、酶水解溫度、酶水解時(shí)間和pH均對木瓜蛋白酶對胡子鯰魚蛋白的水解有影響。本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)（即在其它因素不變的情況下研究某一因素對酶水解效果的影響），確定各因素的最佳條件，再采用L9（34）[10]正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以氨基態(tài)氮含量為指標(biāo)，確定木瓜蛋白酶的最佳酶水解條件。

1.2.4 酶水解液的制備

稱取一定量搗碎的魚粉，按比例加入蒸餾水，預(yù)熱至設(shè)定溫度，調(diào)pH 至規(guī)定值，加酶恒溫水解一定時(shí)間后移至沸水浴中，進(jìn)行滅酶活10 min，離心取上清液即為水解液，定容至100 mL。取酶水解液進(jìn)行測定。

2 實(shí)驗(yàn)過程與結(jié)果分析

2.1 單因素的研究

2.1.1 酶用量對酶水解效果的影響

酶用量對水解度的影響在胡子鯰水解的過程中，木瓜蛋白酶的用量是影響水解程度的一個(gè)因素，在底物濃度為2.5%、溫度為50 ℃，水解時(shí)間4 h、pH 為7.0的條件下，分別配制酶濃度為0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%的胡子鯰漿液，以水解度為考察指標(biāo)，結(jié)果見圖1。

圖1 酶濃度對水解效果的影響Fig.1 Effect of density of protease on hydrolyzation

由圖1 的結(jié)果可看出，隨著酶用量的增加胡子鯰蛋白的水解度逐漸增加，但木瓜蛋白酶的濃度達(dá)到一定程度后，水解度隨著加酶量的變化趨勢有所緩慢。因此，木瓜蛋白酶水解胡子鯰的最佳酶濃度為1.6%左右。

2.1.2 底物濃度對水解效果的影響

分別配制底物濃度為2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%的胡子鯰漿液，調(diào)節(jié)其pH 為7.0，酶濃度為1.6%，50 ℃下水解4 h 后測定其水解度，找出最佳的底物濃度，見圖2。

圖2 底物濃度對水解效果的影響Fig.2 Effect of density of substretum on hydrolyzation

由圖2 可見，底物濃度在3.5%左右胡子鯰水解度相對較高。隨著底物濃度的增加，胡子鯰的水解度有所下降這主要是由于底物濃度過高，體系的有效水濃度降低這就降低了底物與酶的接觸幾率。因此，胡子鯰水解的最佳底物濃度為3.5%左右。

2.1.3 酶水解時(shí)間對酶水解效果的影響

在試驗(yàn)中選取底物濃度為3.5%，酶濃度為1.6%，pH 為7.0，溫度為50 ℃下對胡子鯰蛋白進(jìn)行酶水解，研究酶水解時(shí)間對水解度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 酶水解時(shí)間對水解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on hydrolyzation

由圖3 可見，在最初5 h 內(nèi)水解度隨酶水解時(shí)間的增加而迅速提高，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間（5 h）后，水解度的增加變得緩慢，基本上趨于不變。因此認(rèn)4 h～5 h 為木瓜蛋白酶酶水解胡子鯰蛋白的最佳時(shí)間。

2.1.4 酶水解溫度對酶水解效果的影響

選定底物濃度為3.5 %，酶濃度為1.6 %，pH 為7.0，分別在40、45、50、55、60、65 ℃下水解5 h，通過水解度的具體數(shù)值確定最佳溫度，見圖4。

由圖4 可見，在溫度為40 ℃～50 ℃范圍內(nèi)水解度隨著溫度的提高而增大，當(dāng)溫度再增加時(shí)水解度反而有所下降。這主要是由于溫度對木瓜蛋白酶的影響，溫度太高會使酶滅活，而溫度過低則酶的活性不足，兩者會導(dǎo)致水解度的降低，因此最佳的酶水解溫度為50 ℃左右，這時(shí)酶的活性最高。

圖4 酶水解溫度對水解效果的影響Fig.4 Effect of temperature on hydrolyzation

2.1.5 體系初始pH 對酶水解效果的影響

選取底物濃度為3.5%，酶濃度為1.6%，溫度為50 ℃，在不同pH 條件下水解5 h，確定最佳酶水解pH，見圖5。

圖5 pH 對水解效果的影響Fig.5 Effect of pH on hydrolyzation

由圖5 可看出體系初始pH 對水解度有一定的影響，當(dāng)pH 在6～7.5 范圍內(nèi)，水解度隨著pH 的增加而提高，當(dāng)pH 大于7.5 時(shí)水解度隨著pH 的增加反而有所下降。這就說明采用木瓜蛋白酶水解胡子鯰時(shí)，酶水解液的最適pH 為7.0～7.5 之間。因此，本試驗(yàn)體系的起始pH 固定在7.0。

2.2 胡子鯰最佳酶水解工藝條件的確定

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)，確定了酶用量、底物濃度、酶水解時(shí)間、體系起始pH 以及酶水解溫度。其中體系的起始pH 采用固定值7.0，綜合考慮酶水解過程是同時(shí)受各因素的影響，故采用三水平四因素即L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定酶水解的最佳工藝條件。各因素及相應(yīng)水平見表1。

從表1 可知，在這幾個(gè)因素中，酶濃度對水解效果的影響最為顯著，各因素對胡子鯰魚蛋白酶水解效果影響的大小順序是：酶濃度＞底物濃度＞酶水解溫度＞酶水解時(shí)間。胡子鯰魚蛋白的最佳酶水解條件為A3B1C3D3，因?yàn)樵摋l件沒有出現(xiàn)在正交表里，所以進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即在酶水解溫度為55 ℃的條件下，底物濃度為3.5%，，酶濃度為1.8%，酶水解6 h 后胡子鯰蛋白獲得最大水解度為30.65 %。所得結(jié)果水解度30.65 %＞29.00%（正交表里的最大值），所以該正交試驗(yàn)結(jié)果可靠。

表1 木瓜蛋白酶酶水解胡子鯰蛋白L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 1 Design of L9（34）orthogonal test and experimental result of hydrolysis of Clarias fuscus by papain

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)得出以水解度為考察指標(biāo)，采用木瓜蛋白酶對胡子鯰魚蛋白進(jìn)行水解，水解效果較好。通過對單因素的考察結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)確定木瓜蛋白酶水解胡子鯰魚蛋白的最佳條件是pH7.0，酶濃度為1.8%，底物濃度為3.5%，在溫度為55 ℃，酶水解6 h。在此條件下胡子鯰的水解效果最好，水解度可達(dá)到30.65%。

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