陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 （咸陽712000） 李 宏 田亞寧 董昌虎梁 漫 王 蕾 齊 婧 仝航斌 周智輝

目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，除在科研方面的貢獻巨大之外，對于臨床疾病的診斷和預(yù)后評估方面具有重要的應(yīng)用價值。本文著重從PCR反應(yīng)體系的1個關(guān)鍵因素：Taq DNA聚合酶含量進行實驗研究，尋求最佳的Taq DNA聚合酶PCR反應(yīng)條件。Taq DNA聚合酶是 Mg2＋依賴性酶，因而對 Mg2＋的濃度最為敏感，在PCR反應(yīng)中耐熱DNA聚合酶的活性與反應(yīng)體系中游離Mg2＋濃度直接相關(guān)，反應(yīng)體系中Mg2＋濃度低時，酶的活力顯著降低；過高時，酶則催化非特異性擴增。因此，在固定其他因素的前提下，探討兩者最佳作用濃度，從而提高Taq DNA聚合酶的作用效力，以獲得理想的目的基因的擴增片斷。

材料與方法

1 材 料 實驗標(biāo)本：收集50份正常人的靜脈血，EDTA抗凝。主要儀器及設(shè)備：低溫冰箱、低溫超速離心機、PCR擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)。主要試劑：Taq DNA聚合酶（MBI），Marker（100bp－1500bp，廣州東勝），25 m M MgCl2（MBI），瓊脂糖（Spanish Specifications）。

2 方 法 ①DNA的提取：采用經(jīng)典的酚－氯仿－異戊醇法：在室溫下融化血液，混勻后吸取0．6 ml至離心管中，加入3～5倍體積的紅細胞裂解液（含KHCO3、 NH4Cl、EDTA－Na2），輕柔混勻，冰中放置30 min，中間上下顛倒，輕柔混勻數(shù)次。5000rp m 10 min，棄上清收集細胞。加入1 ml紅細胞裂解液，混勻，冰中靜置10 min。5000r p m 10 min，棄上清收集細胞。重復(fù)前兩步，直到沉淀中肉眼可見之紅色。用150μl的 白 細 胞 裂 解 （含 10 m MTris－Cl p H－8．0，100 m M Na Cl，10 m MEDTA，0．5%SDS，0．1 mg/ml蛋白酶K）液懸浮沉淀，置于37℃水浴中過夜。加入等體積的飽和酚，充分混勻，以12000r/min離心10 min，將上清液移至另一EP管中。加入等體積的氯仿：異戊 醇 （24 ∶ 1）［1］，充 分 混 勻，以 12000r/min 離 心10 min。去上層水相，加入1/10體積的3 MNa AC，2倍體積的冰乙醇，混勻后放置在－20℃靜置1h。以12000r/min離心10 min，小心棄上清。70%的乙醇洗滌兩次，以12000r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥15 min。TE緩沖液溶解DNA，使其A260/280的比值界于1．65～1．80之間，－20℃保存待用。②PCR反應(yīng)體系的設(shè)立及PCR擴增：PCR反應(yīng)體系總體積固定在常用的50μl，DNA模板采用同一個樣本（濃度：50ng/μl）1μl，10×Taq buff er：5μl，10 m Md NTP：1μl，上下游引物各1μl（濃度為：50μmol/L），引物使用HLA微衛(wèi)星引物：MIB（位于：HLA－B基因著絲粒點25 Kb處），上游引物序列：MIB－1：5＇CTA CCA TGA CCC CCT TCC CC3′，下游引物序列：MIB－2：5＇CCA CAG TCT CTA TCA GTC CA3′［2］，擴增產(chǎn)物大小范圍為：326bp。PCR擴增參數(shù)：預(yù)變性95℃5 min；變性52℃1 min，延伸72℃1 min，共35個循環(huán)；終延伸72℃10 min。每次PCR反應(yīng)均設(shè)立空白對照。固定25 m M Mg Cl2的含量為：3μl，通過設(shè)立不同的 Taq DNA聚合酶（濃度為5u/μl）的含量進行PCR反應(yīng)，每個含量級重復(fù)PCR反應(yīng)10次，并進行嚴格的質(zhì)量控制，Taq DNA 聚合酶的含量梯度依次為：0．2μl，0．3μl，0．4μl，0．5μl，0．6μl，0．65μl，0．75μl，0．8μl，0．85μl，0．9μl，0．95μl，1μl；并在1%瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測。Taq DNA聚合酶（濃度為5u/μl）的含量由0．2～1μl。固定 Taq DNA聚合酶（濃度為5u/μl）的含量為：0．5μl，通過設(shè)立不同的25 m M Mg Cl2含量梯度進行PCR反應(yīng)，每個含量重復(fù)PCR反應(yīng)10次，并進行嚴格的質(zhì)量控制，25 m M Mg Cl2含量梯度依次為：1μl，1．5μl，2μl，2．5μl，3μl，3．5μl，4μl，擴增產(chǎn)物的質(zhì)量通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

結(jié) 果

使用經(jīng)典的酚－氯仿－異戊醇法提取的DNA模板純度高，基因組DNA質(zhì)量完好，無蛋白質(zhì)和酚等雜質(zhì)殘留，適合PCR反應(yīng)。擴增產(chǎn)物大小在326～356bp范圍之內(nèi)，符合引物設(shè)計要求，即為所要擴增的目的基因片斷。在固定25 m M Mg Cl2的含量為3μl時，Taq DNA聚合酶（濃度為5u/μl）的含量分別為0．4μl、0．5μl時，PCR擴增效果較好，條代清楚，無脫尾現(xiàn)象，當(dāng)其含量大于0．5μl時，出現(xiàn)非特異行擴增條帶；其余均未出現(xiàn)陽性擴增條帶（包括空白對照組）。當(dāng)Taq DNA聚合酶的含量為0．5μl，25 m M Mg Cl2含量分別為2μl、2．5μl、3μl時PCR擴增效果較好，條帶清楚，在2．5μl和3μl時，有微量拖帶現(xiàn)象。表明 Taq DNA聚合酶的含量稍微過量，造成非特異性擴增。固定 Taq DNA聚合酶（濃度為5u/μl）的含量為：0．5μl，不同的25 m M Mg Cl2含量梯度進行PCR反應(yīng)后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見附圖。

附圖 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

討 論

用于PCR反應(yīng)的模板DNA是PCR擴增得以成功的前提［3］，酚－氯仿－異戊醇法是一種經(jīng)典的方法，提取的DNA純度較高，所獲得的DNA片斷相對完整適于PCR分析以及基因多態(tài)性的研究［4］。本實驗采用酚－氯仿－異戊醇法所提取的DNA經(jīng)紫外分光光度計檢測A260/280比值在1．65～1．80之間，電泳檢測如附圖所見，質(zhì)量較高，完全符合PCR反應(yīng)對模板DNA的要求。在固定 Mg Cl2的含量為：3μl時，Taq DNA聚合酶的含量在0．4μl與0．5μl能夠得到完好的擴增產(chǎn)物，Taq DNA聚合酶的含量在0．6μl時雖然出現(xiàn)條帶，但屬于非特異性擴增，拖尾拖帶現(xiàn)象非常明顯，造成此現(xiàn)象的原因有：酶量過多或酶的質(zhì)量差，d NTP濃度過高，Mg2＋濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起；本實驗排除其他原因，分析出現(xiàn)本實驗出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象的主要因素是DNA聚合酶過量。當(dāng)固定Taq DNA聚合酶的含量為：0．5μl時，Mg Cl2含量分別在2μl、2．5μl、3μl時出現(xiàn)清晰完整的擴增條帶。但仔細觀察發(fā)現(xiàn)在第6、7泳道的擴增產(chǎn)物條帶亮度較強，并且稍有拖尾，不是很明顯，說明Mg2＋的量相對較多。用2μl的25 m M Mg Cl2和0．5μl的Taq DNA聚合酶（5u/μl）反復(fù)擴增多次，電泳檢測發(fā)現(xiàn)條帶規(guī)整無拖尾。PCR反應(yīng)體系是多因素的體系，要考慮到各個因素，對PCR體系不斷的優(yōu)化，必須固定其中的一兩個因素后進行大量的實驗研究才能很好的完善，更好的應(yīng)用于臨床疾病的分子診斷及預(yù)后評估。

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