陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液科 （咸陽(yáng)712000） 楊 艷 王越月 何春玲 田亞寧周智輝 張?jiān)浦?閆昱江 張 楊 劉 芳 梁漫 董紅保 董昌虎

細(xì)胞周期素D1（Cyclin D1）是細(xì)胞周期G1期周期素家族最重要的成員，其表達(dá)失控將引起細(xì)胞增殖周期失調(diào)，而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生；現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，多種組織來(lái)源的腫瘤均有Cyclin D1的過(guò)度表達(dá)，但有關(guān)急性白血病（AL）骨髓組織中該蛋白的研究很少；本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化染色方法，檢測(cè)Cyclin D1單克隆抗體在急性白血病及正常對(duì)照組骨髓組織中的表達(dá)，并結(jié)合急性白血病的臨床分型，探討Cyclin D1在急性白血病發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用。

資料與方法

1 一般資料 本院2010年1月1日至2012年6月30日確診為急性白血病49例患者的骨髓組織標(biāo)本，其中男27例，女22例，年齡16～76歲，中位年齡48歲；急性髓細(xì)胞白血病36例（其中3例由骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)變而來(lái)、2例由慢性髓細(xì)胞白血病急變而來(lái)），急性淋巴細(xì)胞白血病13例；49例患者中29例為初診患者，13例為復(fù)發(fā)患者，7例完全緩解患者。正常對(duì)照組19例，來(lái)自陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科診斷的正常骨髓組織。

2 方法及步驟 取經(jīng)冷丙酮固定、塑料包埋的存檔骨髓組織塊，制成2～3μm組織切片，裱片于用稀釋多聚－L－賴(lài)氨酸處理的載玻片上，吹干，用專(zhuān)用油筆圈定玻片上的待測(cè)組織區(qū)域，PBS液沖洗后滴加100μl Cyclin D1抗體（兔抗人單克隆抗體，福建邁新生物科技有限公司，批號(hào)：120510541B），室溫下孵育60 min后PBS液沖洗，加100μl酶標(biāo)羊抗小鼠/兔Ig G聚合物，室溫下孵育15 min，PBS液沖洗后加100～200μl新鮮配制的DAB顯色液，室溫下孵育3～5 min，自來(lái)水沖洗，加蘇木素染色至細(xì)胞核淺藍(lán)色，PBS液沖洗返藍(lán)；酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察，判斷結(jié)果。

3 判斷標(biāo)準(zhǔn) Cyclin D1判斷標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞核呈彌漫的棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，在顯微鏡下觀測(cè)，選擇2個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞中Cyclin D1著色的細(xì)胞比例數(shù)，求出平均值，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分率分為以下五個(gè)等級(jí)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞者為陰性；1%～10%為（＋）；11%～20%（）；21%～30%（）；≥31%（）。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17．0軟件包進(jìn)行Mann－Whit ney Test秩和檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Cyclin D1在急性白血病組及對(duì)照組骨髓組織中的表達(dá) 見(jiàn)表1。分組變量檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：統(tǒng)計(jì)量U＝304．000，雙側(cè)漸近概率P＜0．05，故可認(rèn)為急性白血病組與對(duì)照組的Cyclin D1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Cyclin D1在急性白血病組及對(duì)照組骨髓組織中的表達(dá)

2 Cyclin D1在初發(fā)未治、復(fù)發(fā)難治及完全緩解的AL的表達(dá) 見(jiàn)表2。復(fù)發(fā)難治患者（8/13）骨髓組織中Cyclin D1的表達(dá)高于初發(fā)未治患者（9/29），3組資料比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

表2 Cyclin D1在初發(fā)未治、復(fù)發(fā)難治及完全緩解的AL的表達(dá)

3 Cyclin D1在急性白血病骨髓組織中表達(dá)的特點(diǎn) 見(jiàn)附圖。急性白血病骨髓組織中用Cyclin D1抗體，經(jīng)S－P染色后，可見(jiàn)骨髓內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)在細(xì)胞核上。

附圖 急性白血病骨髓組織中Cyclin D1經(jīng)S－P染色陽(yáng)性細(xì)胞（×40）

討 論

在惡性腫瘤發(fā)生機(jī)理的研究中，越來(lái)越多的研究表明，細(xì)胞周期素（Cyclins）－細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶（CDKs）－細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶抑制蛋白（CKIs）系統(tǒng)作為細(xì)胞分裂、增殖的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在腫瘤的發(fā)生學(xué)上起著極為重要的作用，Cyclin D1能夠激活細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶（CDKs），調(diào)控細(xì)胞的分裂和增殖，阻滯Cyclin D1的表達(dá)可阻斷細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，而Cyclin D1的過(guò)度表達(dá)，可導(dǎo)致p RB蛋白的磷酸化修飾提前實(shí)現(xiàn)，加速細(xì)胞G1期到S期的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞的增殖［1］；Cyclin D1是G1期周期素，其活化是腫瘤發(fā)生的重要原因之一［2］；近幾年的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中都存在Cyclin D1基因結(jié)構(gòu)和功能異常［3－8］；它在診斷、治療及預(yù)后評(píng)估上的應(yīng)用價(jià)值也是目前腫瘤研究中的熱點(diǎn)之一，但有關(guān)Cyclin D1在骨髓組織中的表達(dá)卻鮮見(jiàn)報(bào)道。

白血病是血液系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，我們對(duì)急性白血病骨髓組織中Cyclin D1的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，正常骨髓中未見(jiàn)Cyclin D1的表達(dá)，而急性白血病組骨髓組織中Cyclin D1的陽(yáng)性率為34．69%，提示Cyclin D1的異常表達(dá)與血液系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤—急性白血病的發(fā)生有一定的關(guān)系；有研究表明，幾乎所有的cyclins都可能作為一種原癌基因被激活后在腫瘤發(fā)生中起癌基因的作用［9］，吳玉新等［10］研究也表明細(xì)胞周期素D1與多種不同類(lèi)型人類(lèi)腫瘤的診斷和預(yù)后有關(guān)。

研究的49例急性白血病患者中，有32例患者未出現(xiàn)Cyclin D1的表達(dá)，而有17例患者均不同程度的出現(xiàn)Cyclin D1的表達(dá)，其中復(fù)發(fā)難治患者的陽(yáng)性率高于初發(fā)未治患者，尤其是3例由骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)變的急性髓細(xì)胞白血病患者中有2例Cyclin D1呈高表達(dá)（／），2例由慢性髓細(xì)胞白血病急變而來(lái)的急性髓細(xì)胞白血病患者Cyclin D1均呈高表達(dá)（／），7例完全緩解患者中Cyclin D1的表達(dá)均為陰性，其結(jié)果與李紅華等［11］所研究結(jié)果相似；對(duì)上述急性白血病患者化療1～2周期后緩解情況進(jìn)行觀察顯示，Cyclin D1陰性表達(dá)患者的緩解率明顯高于其陽(yáng)性表達(dá)患者，提示Cyclin D1的陽(yáng)性程度與急性白血病的臨床病情及預(yù)后情況有一定關(guān)系，其高表達(dá)往往提示病情危重，預(yù)后較差。

在研究的49例急性白血病患者中，急性髓細(xì)胞白血病及急性淋巴細(xì)胞白血病中均有Cyclin D1的表達(dá)，但由于病例過(guò)少，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)二者是否存在差異還需進(jìn)一步積累資料。

綜上所述，急性白血病骨髓組織中Cyclin D1表示屬無(wú)毒級(jí)，致癌、致畸及致突變實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌培養(yǎng)均為陰性［3］，成人急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為L(zhǎng)D50＞13g/kg，屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)；無(wú)致癌、致畸性；另外，它還能在體內(nèi)分解、排泄，無(wú)毒性累積［4］。

使用醫(yī)用膠固定補(bǔ)片的另一個(gè)顧慮是其可降解性，因α－氰基丙烯酸酯聚合體在體內(nèi)可以被代謝，完全排泄。但其在體腔內(nèi)和組織內(nèi)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)表明，化學(xué)性醫(yī)用膠用于人體和動(dòng)物體內(nèi)，根據(jù)用膠量，將于3～9個(gè)月才被逐漸降解吸收；而根據(jù)補(bǔ)片修補(bǔ)的原理，對(duì)于有足夠微孔大小的疝補(bǔ)片來(lái)說(shuō)，成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維蛋白的形成、且產(chǎn)生較穩(wěn)定的瘢痕組織大約需要1個(gè)月時(shí)間，組織損傷修復(fù)的纖維增生期也在1個(gè)月內(nèi)完成，而術(shù)后3個(gè)月植入補(bǔ)片與宿主組織的融合已相當(dāng)牢固。因此，雖然化學(xué)性醫(yī)用膠在體內(nèi)使用后3～9個(gè)月降解吸收，但已為維持補(bǔ)片的固定提供了充足時(shí)間。也有人認(rèn)為該醫(yī)用膠28d后的強(qiáng)度比縫線低30%［5］，故并不能完全代替手術(shù)縫線，只是用于傷口的邊緣且要配合縫線一起使用［6］。

醫(yī)用膠在腹外疝術(shù)中使用注意事項(xiàng)。由于化學(xué)性醫(yī)用膠是一種粘合封閉劑，凝固快，會(huì)形成堅(jiān)硬的膠合，封閉網(wǎng)孔，所以易造成感染或形成補(bǔ)片下的血腫與血清腫，所以我們的經(jīng)驗(yàn)是應(yīng)該點(diǎn)狀應(yīng)用于補(bǔ)片的粘合，而不能大面積涂抹封閉；手術(shù)創(chuàng)面使用醫(yī)用膠也應(yīng)采用少量、薄層涂抹止血的方法。

在無(wú)張力疝修補(bǔ)術(shù)中應(yīng)用一些新工藝、新材料，并借此來(lái)降低術(shù)后各種并發(fā)癥的發(fā)生和提高療效是疝外科發(fā)展的一大趨勢(shì)。我們?cè)诟构蓽橡轑ichtenstein平片無(wú)張力修補(bǔ)術(shù)中應(yīng)用化學(xué)性醫(yī)用膠固定補(bǔ)片和創(chuàng)面止血取得了較好療效，沒(méi)有因?yàn)檠a(bǔ)片固定不牢靠而復(fù)發(fā)的病例，沒(méi)有發(fā)生傷口感染，可以減輕術(shù)后疼痛，減少慢性疼痛和血腫的發(fā)生，節(jié)省了手術(shù)時(shí)間。

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