鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科（鄭州450052） 范正軍 彭 飛 薛建峰 程 波 劉艷杰

目前國內(nèi)外對原發(fā)性肝癌（PLC）的發(fā)病機(jī)制的研究涉及多發(fā)面、多層次的內(nèi)容，從分子生物學(xué)水平來說，其發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移與多基因突變、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和異常新生血管增生等密切相關(guān)。已有學(xué)者研究指出肝腸鈣粘連蛋白（LI－cadherin）與肝癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲性相關(guān)，但具體機(jī)制尚未闡明［1］，本文應(yīng)用si RNA干擾技術(shù)下調(diào)人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株Hep3B中 LI－cadherin的表達(dá)，研究 LI－cadherin對人肝癌細(xì)胞增值的影響，并初步探討其機(jī)制。

材料與方法

1 材 料 Hep3B人肝癌細(xì)胞株購自于上海漢博生物科技有限公司，脂質(zhì)體Lipofectamine T M，2000、TRIzol試劑盒購自于美國Invitr ogen公司，氨芐青霉素、RPMI1640培養(yǎng)基、溴化乙錠（EB）、胰酶細(xì)胞消化液、DNA Ladder Mar ker購自于大連寶生物工程有限公司，膠回收試劑盒、10%胎牛血清（FBS）、G418購自于GIBCO公司，低熔點(diǎn)瓊脂糖粉購自于英國Oxoid公司，LI－cadherin Si RNA（sc－43014）、Contr ol Si RNA（sc－37007）、Wester n blotting 檢測試劑盒購自于美國Santa公司，二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮哇鹽（MTT）購自于美國Sig ma公司，蛋白提取試劑盒、蛋白提取緩沖液購自于北京天恩澤基因科技有限公司。LB培養(yǎng)基、RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)液、50×（Tris－AC）電泳緩沖液（TAE）、瓊脂糖電泳凝膠、100μg/ml氨芐青霉素、MTT溶液、PI染液、0．25%胰蛋白酶消化液、Transfer buffer for wester n bl otting（1000 ml），所有實(shí)驗(yàn)試劑均嚴(yán)格按照說明書仔細(xì)配置。

2 方 法 ①細(xì)胞培養(yǎng)及LI－cadherin轉(zhuǎn)染：將Hep3B細(xì)胞于37℃含10%PBS的培養(yǎng)液中解凍，加入10 ml RPM－1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，于37℃含5%CO2孵箱培養(yǎng)、10 ml含10%胎牛血清但不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)，胰蛋白酶液消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象。si RNAs轉(zhuǎn)染用 Lipofectamine T M2000脂質(zhì)體并嚴(yán)格按照操作說明書的轉(zhuǎn)染條件及步驟進(jìn)行細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染，72h后收獲細(xì)胞進(jìn)行檢測和實(shí)驗(yàn)。按照轉(zhuǎn)染內(nèi)容的不同進(jìn)行細(xì)胞分組，即LI－cadherin轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染LI－cadherin特異性Si RNA；陰性對照組：加入等量的轉(zhuǎn)染試劑并轉(zhuǎn)染同濃度的非干擾si RNA；空白對照組：常規(guī)培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株Hep3B。②實(shí)驗(yàn)組LI－cadherin及Cyclin D1蛋白表達(dá)的變化：采用 Western－blotting法檢測各實(shí)驗(yàn)組LI－cadherin及Cyclin D1蛋白表達(dá)的變化情況。各組蛋白樣品提取后，根據(jù)待測的蛋白分子量的不同分別灌以不同濃度的的積層膠和分離膠，按照 Western－blotting法實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格操作。③LI－cadherin對肝癌細(xì)胞Hep3B生長的作用：利用 MTT法重復(fù)三次分別檢測Li－cadherin－Si RNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞、陰性對照及空白對照組在490nm波長下細(xì)胞第12h、24h、36h、48h、72h及96h 6個時間點(diǎn)的光吸收值（OD值），并記錄結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最后以時間作為橫軸，光吸收值為縱軸繪制各組細(xì)胞的生長曲線。④檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期：將瞬時轉(zhuǎn)染后72h正處于對數(shù)生長期的3組細(xì)胞分別以1×106接種到6孔板，每組細(xì)胞接種3孔，長至80%匯合度，棄去培養(yǎng)液，用3 ml PBS緩沖液小心洗滌兩次，0．25%胰蛋白酶－EDTA消化液消化后制成細(xì)胞懸液，加入PI（100μg/ml）和5μl Rnase，37℃恒溫箱內(nèi)靜置30 min，使用美國BD公司Epics－XLⅡ型流式細(xì)胞儀（FCM），通過FSC/SSC散點(diǎn)圖收集10000個細(xì)胞，采用設(shè)門技術(shù)排除粘連細(xì)胞和細(xì)胞碎片，由Cellquest軟件分析G0/G1，S，G2/M期細(xì)胞含量百分比，并分析細(xì)胞的增殖指數(shù)：PI［14］＝（S＋G2/M）/（G0/G1＋S＋G2/M）×100%。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染Si RNA后轉(zhuǎn)染效率觀察 利用熒光倒置顯微鏡分別觀察三組細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染入Si RNA后的Hep3B細(xì)胞中可見清晰的熒光，說明轉(zhuǎn)染成功。計(jì)算視野內(nèi)發(fā)出熒光的細(xì)胞占全部細(xì)胞的85%，即轉(zhuǎn)染效率為85%，符合本實(shí)驗(yàn)的基本條件。見圖1。

圖1 LI－cadherin－Si RNA轉(zhuǎn)染 Hep3B細(xì)胞的效率

2 轉(zhuǎn)染Si RNA后LI－cadherin與細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后普通培養(yǎng)72h，通過Wester n－blotting檢測發(fā)現(xiàn)空白對照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的LI－cadherin的蛋白表達(dá)率無明顯差異（P＞0．05），Si RNA轉(zhuǎn)染組LI－cadherin的表達(dá)均低于空白對照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，說明LI－cadherin抑制有效；Si RNA轉(zhuǎn)染組與空白對照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，Cyclin D1蛋白表達(dá)明顯升高。見圖2。

圖2 Si RNA轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞后LI－cadherin及Cyclin D1的表達(dá)

3 LI－cadherin對肝癌細(xì)胞生長的作用 見表1。通過MTT方法分別檢測6個時間點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，Si RNA轉(zhuǎn)染組在12h、24h、36h時陰性對照組和空白對照組細(xì)胞均開始了增值，轉(zhuǎn)染組生長高于空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，但是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異（P＞0．05），48h、72h、96h肝腸鈣粘連蛋白Si RNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞株生長明顯加快，明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見圖3。

表1 LI－cadherin對肝癌細(xì)胞株Hep3B生長的作用（n＝6）

圖3 LI－cadherin對肝癌細(xì)胞生長的作用

4 流式細(xì)胞儀檢測肝腸鈣粘連蛋白對肝癌細(xì)胞周期的影響 見表2。Si RNA轉(zhuǎn)染組 Hep3B－LI－cadherin－Si RNA細(xì)胞與空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比S期及G2/M期百分含量明顯增多，G0/G1期百分含量明顯減少，PI較高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比各期細(xì)胞百分比及PI值變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。Si RNA轉(zhuǎn)染組與空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比Cyclin D1蛋白的表達(dá)明顯升高（P＜0．05），而空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Cyclin D1蛋白變化無明顯差異（P＞0．05）。此結(jié)果提示下調(diào)LI－cadherin的表達(dá)后，明顯增加了Cyclin D1蛋白的表達(dá)，同時促進(jìn)G1向S期轉(zhuǎn)化，加快細(xì)胞的分裂、促進(jìn)細(xì)胞增殖。

表2 CDH17對肝癌細(xì)胞周期的影響

討 論

經(jīng)典鈣粘連蛋白的細(xì)胞質(zhì)的鈣連環(huán)部分由150個氨基酸殘基組成，是一個基因序列高度穩(wěn)定的保守區(qū)域，而肝腸鈣粘連蛋白的細(xì)胞質(zhì)的鈣連環(huán)片段卻僅由20個氨基酸殘基組成，其基因結(jié)構(gòu)上決定其是不穩(wěn)定區(qū)域，同時發(fā)現(xiàn)LI－cadherin的細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白（actins）和鈣粘連環(huán)蛋白（catenins）之間的相互作用表達(dá)受限和異常減少［2］。有研究表明，LI－cadherin在直腸癌、胃癌等多種上皮源性腫瘤組織及腫瘤組織周圍有表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)LI－cadherin與腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲性相關(guān)，范正軍等［3］通過對56例直徑不等的肝癌標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)LI－cadherin與肝癌的直徑呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，并表明LI－cadherin可抑制肝癌的生長，相反陳筱婷等［4］利用單克隆抗體技術(shù)沉默LI－cadherin基因的表達(dá)進(jìn)而抑制了肝癌細(xì)胞株的增殖，在體外證明了LI－cadherin可促進(jìn)肝癌的生長，但其未做相關(guān)機(jī)制研究，闡述不夠充分。

目前已有研究證實(shí)，多種腫瘤中都存在Cyclin D1基因結(jié)構(gòu)和功能異常，如肺癌［5－6］、食管癌［7］和肝癌［8－9］等，Cyclin D1在腫瘤的診斷、預(yù)后以及治療方面的價值可觀，已成為目前惡性腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)話題。本實(shí)驗(yàn)通過si RNA技術(shù)轉(zhuǎn)染Hep3B并經(jīng)蛋白免疫印跡檢測LI－cadherin蛋白表達(dá)證明有效下調(diào)后，通過MTT法檢測表明si RNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在12、24、36h與兩個對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在第36h檢測時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組生長明顯較快，在48h以后則表現(xiàn)出了明顯的差異性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其可抑制肝癌細(xì)胞的生長。通過研究3組細(xì)胞在培養(yǎng)第72h表現(xiàn)出生長顯著差異性時，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期并通過DNA含量的不同計(jì)算各時相的比例發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LI－cadherin表達(dá)的轉(zhuǎn)染組G0/G1期占細(xì)胞周期含量分布的23．18%，較對照組低，S期占45．37%以及G2/M期占30．59%，均較對照組高，增值指數(shù)（P I）達(dá)77%也顯著高于對照組，表明生長明顯增快的Si RNA轉(zhuǎn)染組生長分?jǐn)?shù)較高，而對照組生長分?jǐn)?shù)較低。通過對比各組細(xì)胞各細(xì)胞周期分布的不同，我們進(jìn)一步在實(shí)驗(yàn)中檢測調(diào)節(jié)G1/S期的細(xì)胞周期蛋白D1，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組CCND1表達(dá)量明顯高于對照組，因此我們推測，特異性沉默Hep3B細(xì)胞的LI－cadherin基因后，其生長速度增快，很可能是因?yàn)長I－cadherin基因的沉默刺激了CCND1基因的改變并過度表達(dá)，使G0期靜止的激活進(jìn)入S期，且縮短了G1期，加速進(jìn)入S期，促進(jìn)了腫瘤的快速生長，同時間接說明肝腸鈣粘連蛋白可能通過細(xì)胞周期蛋白D1調(diào)控細(xì)胞周期而起到抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。

［1］范正軍，房祥杰，王家祥，等．肝腸鈣粘連蛋白對人肝癌細(xì)胞粘附和遷移的作用［J］．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28（8）：1396．

［2］Ueta T，Ikeguchi M，Hirooka Y，et al．Beta－catenin and cyclin D1 expression in hu man hepatocellular carcinoma［J］．Oncol Rep，2002，9：1197－1203．

［3］范正軍．肝腸鈣粘連蛋白與肝細(xì)胞癌的關(guān)系及對粘附和侵襲作用的初步研究［D］．鄭州大學(xué)外科學(xué)，2011．

［4］陳筱婷，杜紅延，原少斐，等．肝腸鈣粘連蛋白單克隆抗體的制備及其對Hep G2的生長抑制作用［J］．南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29（5）：880－883．

［5］Hirsch FR，Witta S．Bio mar kers for prediction of sensitivity to EG2FR inhibitors in non－s mall cell lung cancer［J］．Curr Op in Oncol，2005，17（2）：118－122．

［6］Hirsch FR，Witta S．Bio mar kers for prediction of sensitivity to EG2FR inhibitors in non－s mall cell lung cancer［J］．Curr Op in Oncol，2005，17（2）：118－122．

［7］Donnellan R，Chetty R．Cyclin D1 and hu man neoplasia［J］．Clin Pathol Mol Part，1998，51：127．

［8］黃光琳．肝癌血清標(biāo)志物研究進(jìn)展［J］．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2010，39（12）：1681－1682．

［9］Makdissi FB，Machado LV，Oliveira AG．Expression of E－cadherin，Snail and Hakai in epit helial cells isolated fro m the pri mary tu mor and fr o m perit u moral tissue of invasive ductal breast carcino mas［J］．Braz J Med Biol Res，2009，42（12）：1128－1137．