西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 （西安710061） 穆 喆 耿希剛

由于胰腺癌早期癥狀不明顯，待出現(xiàn)癥狀多已為中晚期，失去最佳治療機(jī)會(huì)，且胰腺位置毗鄰重要臟器，給手術(shù)和放療造成了很大的困難。至今，胰腺癌的治療效果并不令人滿意，5年生存率僅僅從20世紀(jì)70年代的3%上升至4%［1］。對(duì)胰腺癌，尤其是晚期的胰腺癌，雖然主要采用吉西他濱等化療方案，由于其毒副作用等的限制，未能有很好的綜合效果，分子靶向藥物的療效也有待進(jìn)一步提高，因而胰腺癌的治療方案，仍需要進(jìn)一步的探討，可能的治療思路，來自對(duì)胰腺癌細(xì)胞的高度依賴的糖酵解途徑（Wer ber g效應(yīng)）［2］進(jìn)行攔截。1962年，Br own［3］報(bào)道了2－脫氧葡萄糖（2－Deoxyglucose，2－DG）對(duì)腫瘤有抑制作用后，2－DG 作為抗腫瘤藥物引起了人們的關(guān)注。2－DG和葡萄糖具有相似的結(jié)構(gòu)，被腫瘤細(xì)胞攝取后，能夠和細(xì)胞內(nèi)的己糖激酶［4－5］結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制己糖激酶的活性，阻礙糖酵解的進(jìn)一步進(jìn)行，干擾腫瘤細(xì)胞ATP的合成，從而阻斷腫瘤細(xì)胞的能量來源［6－7］，造成細(xì)胞內(nèi)ATP剝奪，使得細(xì)胞死亡。隨著更深入的研究，人們發(fā)現(xiàn)2－DG對(duì)腫瘤細(xì)胞還有其他的作用機(jī)制，如對(duì)糖基化的抑制［8］，對(duì)凋亡的誘導(dǎo)［9］以及聯(lián)合化療藥物以及非常規(guī)化療藥等形成放化療增敏等作用［9－11］。本實(shí)驗(yàn)基于2－DG對(duì)腫瘤的抑制作用以及聯(lián)合抑制作用［12］，使用2種不同種系的胰腺癌細(xì)胞系，觀察2－DG聯(lián)合廣譜抗腫瘤藥物順鉑對(duì)胰腺癌細(xì)胞系體外抑制作用以及凋亡的誘導(dǎo)作用。

材料與方法

1 細(xì)胞以及分組 人類胰腺癌細(xì)胞系1420（Mia）、1469（Panc－1）由西安交通大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室以及細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，每組正常培養(yǎng)以及傳代，待穩(wěn)定傳代3～4代后投入使用。

2 主要試劑 DMEM（高糖，4500 mg/L）培養(yǎng)基購自Sig ma公司；胎牛血清購自Gibco公司；Annexin V－FITC凋亡試劑盒購自珠海健康元生物醫(yī)藥公司；順鉑凍干粉針（10 mg）購自齊魯藥業(yè)；MTT、DMSO購自Sig ma公司，caspase－3檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物公司。

3 主要儀器 離心機(jī)為西安交通大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室器材，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀為交通大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室器材，流式細(xì)胞儀為西安交通大學(xué)細(xì)胞與分子生物實(shí)驗(yàn)室器材。

4 操作步驟 ①細(xì)胞培養(yǎng)：將人類胰腺癌細(xì)胞系1420（Mia）、1469（Panc－1）細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，放置于37℃，5%CO2中孵育，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期后，使用0．25%胰蛋白酶消化后，細(xì)胞離心傳代。待細(xì)胞貼壁后，按照不同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理。②MTT實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人類胰腺癌細(xì)胞系1420（Mia）、1469（Panc－1）細(xì)胞株各分成4組：空白對(duì)照組（僅加培養(yǎng)基）、2－DG組（培養(yǎng)基中增加梯度為1 mg/L的2－DG）、順鉑組（培養(yǎng)基中增加1 mg/L濃度的順鉑）、二藥聯(lián)合組（培養(yǎng)基中增加梯度為1 mg/L濃度的順鉑以及1 mg/L的2－DG）。胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至3000個(gè)/ml，種植于96孔板中，每組設(shè)立6個(gè)復(fù)孔。2d更換一次培養(yǎng)液。24h和48h后，每孔加入200μl CCK－8后靜置4h，移至酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的細(xì)胞在490n m處的吸光值［D490］。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，繪制出細(xì)胞的生長(zhǎng)以及抑制曲線。③凋亡和通路檢測(cè)：給藥8h后，使用Annexin V－FITC凋亡試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)和caspase－3活性檢測(cè)。

5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)獲取的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，使用SPSS19．0進(jìn)行單因素方差分析，α＝0．05。

結(jié) 果

經(jīng)過24h、48h MTT測(cè)試及8h凋亡檢測(cè)得知，2－DG對(duì)2種不同種系的細(xì)胞系都有不同程度的抑制作用。而對(duì)細(xì)胞的抑制強(qiáng)度基本與凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果平行，提示2－DG對(duì)胰腺癌細(xì)胞系的抑制作用可能和對(duì)caspase－3通路介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)有關(guān)。

1 MTT檢測(cè) 2－DG和順鉑聯(lián)合使用對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響，和空白對(duì)照組比較，2－DG和順鉑均可降低腫瘤細(xì)胞的活力，二藥聯(lián)合對(duì)細(xì)胞活力影響更為明顯，各組結(jié)果均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖1、2。

圖1 Panc－1細(xì)胞使用不同處理的24h和48h MTT結(jié)果

圖2 Mia細(xì)胞使用不同處理的24h和48h MTT結(jié)果

2 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 由機(jī)制上而言，2－DG在低糖狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞作用更明顯，本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行低糖狀態(tài)下的凋亡檢測(cè)。圖a為未處理的對(duì)照組凋亡率；圖b為單用2－DG組的凋亡率；圖c為單用順鉑組的凋亡率；圖d為二藥聯(lián)合組的凋亡率。見圖3、4。

圖3 Panc－1細(xì)胞經(jīng)不同處理后8h凋亡檢測(cè)

3 caspase－3檢測(cè) caspase－3檢測(cè)結(jié)果提示，2－DG對(duì)細(xì)胞的凋亡可能通過caspase－3活性的增強(qiáng)來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，以下為給藥8h后使用caspase－3凋亡試劑盒檢測(cè)的細(xì)胞caspase－3活性，提示2－DG對(duì)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)可能是通過caspase－3凋亡途徑起作用的，見圖5。

圖4 Mia細(xì)胞經(jīng)不同處理后8h凋亡檢測(cè)

圖5 Panc－1細(xì)胞與Mia細(xì)胞經(jīng)不同處理后8h caspase－3活性檢測(cè)結(jié)果

討 論

除了經(jīng)典的糖酵解抑制途徑，2－DG還可以抑制腫瘤細(xì)胞的糖基化，干擾蛋白質(zhì)的組裝。未組裝的蛋白質(zhì)沉積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，可以對(duì)細(xì)胞造成應(yīng)激，并啟動(dòng)一系列的凋亡通路來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［13］。

在本實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，2－DG在對(duì)2種胰腺癌的細(xì)胞系中，都有或強(qiáng)或弱的抑制作用。對(duì)于作用的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)初步觀察到的，是2－DG通過誘導(dǎo)caspase－3通路對(duì)各種胰腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］。這可能是藥物抑制胰腺癌細(xì)胞的機(jī)制之一，提示2－DG對(duì)廣譜抗腫瘤藥物順鉑可能存在協(xié)同作用。更多的機(jī)制，以及引起凋亡的進(jìn)一步機(jī)制，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

目前國(guó)際上對(duì)2－DG在體外試驗(yàn)有一系列的研究，然在人體試驗(yàn)上缺乏足夠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)［14］，可能的原因是口服給藥的首關(guān)消除或靜脈給藥的紅細(xì)胞毒性的考慮。隨著加速器質(zhì)譜等痕量定量技術(shù)的逐漸完善，對(duì)2－DG的機(jī)制及臨床研究將有進(jìn)一步的深化。

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