西安市第九醫(yī)院神經(jīng)外科（西安710054） 張西安 馬康孝 劉展會 宋錦寧

彌漫性軸索損傷（DAI）是一種特殊類型的腦外傷，是指在頭部遭受特殊鈍性外力作用下由于剪應(yīng)力的影響，腦內(nèi)發(fā)生的廣泛神經(jīng)軸索變性、斷裂、軸索回縮球形成為主要病理特征的改變［1］。神經(jīng)軸索聚集區(qū)是DAI的好發(fā)部位，比如腦灰質(zhì)白質(zhì)交界區(qū)、胼胝體、腦干的橋腦基底部、小腦上腳等是神經(jīng)纖維較集中的部位。創(chuàng)傷性腦水腫屬于繼發(fā)性腦損傷決定了腦外傷患者的預(yù)后。AQP－4在創(chuàng)傷性腦水腫的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用［2］，參與了腦水腫的病理過程。DAI早期即出現(xiàn)腦干腫脹，此時腦干區(qū)含水量及AQP－4變化將產(chǎn)生相應(yīng)的變化。研究發(fā)現(xiàn)高壓氧（HBO）對腦外傷后腦水腫有促進其消退作用［3－4］。HBO治療會對DAI大鼠腦干水腫有減輕作用，也將對腦干區(qū)AQP－4表達產(chǎn)生一定的作用。本實驗通過使用HBO對DAI大鼠進行治療，觀察治療后大鼠腦干區(qū)腦水腫及AQP－4的變化規(guī)律，初步探討HBO的治療機制。

材料與方法

1 材 料 健康雄性成年S－D大鼠110只，體重230～330g，110只大鼠共分為假損傷組（n＝10），DAI組（n＝50）及治療組（n＝50），其中DAI組及治療組按損傷后的時間又分為6h、1d、3d、5d及7d共5個亞組（n＝10，其中5只用于腦干含水量的測定，另外5只用于AQP－4免疫組化）。主要試劑及耗材：兔抗AQP－4抗體（北京博奧森公司），通用型SP檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），Oly mpus BX－40光學(xué)顯微鏡（日本Ol y mpus公司），Leica－Q550CW圖像采集與分析系統(tǒng)（德國Leica公司），高壓氧艙 （煙臺，GY－2200型）

2 實驗方法 ①彌漫性軸索損傷大鼠模型的制作：采用劉曉斌等［5］研制的大鼠頭顱瞬間側(cè)向旋轉(zhuǎn)裝置，依據(jù)先前的實驗結(jié)果，選擇使用該裝置帶動大鼠頭顱在冠狀面旋轉(zhuǎn)90°，制備大鼠DAI模型。先使用10%水合氯醛行腹腔麻醉大鼠，然后將其固定于旋轉(zhuǎn)損傷裝置上，在大鼠掙扎的間歇期扣下扳機，裝置遂致大鼠頭顱瞬間在冠狀面旋轉(zhuǎn)90°。而假損傷組，將麻醉的大鼠固定完畢后即從裝置上卸下。②高壓氧治療：DAI模型制作成功1h后立即將DAI大鼠置入特制的有機玻璃箱中在箱頂設(shè)排氣口，箱下方設(shè)供氧入口。將有機玻璃箱置于大型高壓氧艙內(nèi)，艙內(nèi)溫度、濕度按治療常規(guī)設(shè)定，使用純氧洗艙10 min后艙內(nèi)氧氣濃度升至95．0%以上，經(jīng)過緩慢升壓20 min，艙內(nèi)壓力升至0．2 MPa（2 ATA）后，穩(wěn)定60 min，并持續(xù)給氧60 min，吸氧完成后勻速減壓20 min至常壓，每日治療1次。③腦干含水量測定：將假損傷組、DAI組及DAI治療組分別于傷后6h、1d、3d、5d、7d處死，開顱取全腦后再留取腦干部分，取材后以濾紙吸去腦干表面血跡和腦脊液，立即用電子分析天平稱濕重。分析天平稱濕重后置于80℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥48～72 h至恒重后，稱干重。按Elliot公式干－濕比重法計算腦含水量［6］：腦含水量＝（濕重－干重）/濕重×100%。④灌注及取材：在各個組預(yù)定時間點行腹腔麻醉后，左心室插管至升主動脈，依次使用生理鹽水350 ml，再用4%多聚甲醛溶液250 ml灌注，完畢后開顱取腦并置于4%多聚甲醛溶液，4℃下浸泡固定24h。將固定好的腦組織取腦干上端修塊，流水下沖洗，常規(guī)梯度酒精脫水，透明及浸蠟包埋。將蠟塊連續(xù)冠狀切片，片厚約5μm，每個腦塊5張，表于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60℃恒溫烤箱烘干用于AQP－4免疫組化染色。⑤免疫組化步驟：將脫蠟處理后的腦切片塊置于0．01 M 檸檬酸鹽中，經(jīng)100℃下孵育15 min來進行抗原修復(fù)，然后3%過氧化氫溶液封閉，然后分別在用0．01 M PBS配制的兔抗AQP－4多克隆抗體（北京博奧森，1∶100）中孵育（1h，37℃），繼而滴加生物素標記的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）孵育（30 min，37℃），切片使用SP檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）按操作說明孵育，DAB完成顯色。蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，放入37℃恒溫烤箱過夜后即可顯微鏡下觀察。⑥免疫組化方法測定AQP－4的表達：采用免疫組化評分［7］的方法對 AQP－4蛋白表達進行半定量分析。Oly mpus BX－40光學(xué)顯微鏡（日本Oly mpus公司）下觀察，每張切片觀察5個連續(xù)40倍視野，具體方法如下：A為陽性細胞所占研究細胞整體的百分比（無表達，0；1～10%細胞表達，1；11～50%細胞表達，2；51～80%細胞表達，3；81～100%細胞表達，4）。B為所有陽性細胞評分總和（陰性計0分；弱陽性計1分；中陽性計2分；強陽性計3分）。A乘以B除以研究的總細胞數(shù)即為免疫組化評分結(jié)果。⑦ 圖像采集與分析：Leica－Q550CW圖像采集與分析系統(tǒng)采集免疫組化染色圖像。每張免疫組化切片在預(yù)定范圍內(nèi)隨機選擇6個高倍視野（40×）進行免疫組化評分。

結(jié) 果

1 大鼠腦干含水量的測定 見表1。與假損傷組大鼠比較，DAI組大鼠損傷后6h腦干含水量較假損傷組明顯升高（P＜0．05），至損傷后1d腦干含水量到達高峰，隨后腦干含水量逐步下降，損傷后3d及5d腦干含水量仍顯著高于假損傷組（P＜0．05），損傷后7d與假損傷組大鼠無明顯差異（P＞0．05）。經(jīng)高壓氧治療的損傷后6h，1d，3d和5d組大鼠腦干含水量與相應(yīng)時間點DAI組比較均有明顯降低（P＜0．05）。經(jīng)高壓氧治療的損傷后7d組大鼠腦干含水量為與對應(yīng)時間點的損傷組無明顯差異（P＞0．05）。

表1 假損傷組、DAI組、治療組大鼠腦干含水量的測定結(jié)果（）

表1 假損傷組、DAI組、治療組大鼠腦干含水量的測定結(jié)果（）

注：與假損傷組比較＊P＜0．05；與同一時間點DAI組比較 △P＜0．05

組 別 6h 1d 3d 5d 7d DAI組 75．44±0．53* 77．62±0．81* 75．93±0．39* 74．67±0．54* 73．80±0．68治療組 74．13±0．45△ 75．84±0．61△ 74．36±0．81△ 73．36±0．37△ 73．22±0．49假損傷組 72．48±0．39

2 免疫組化法測定AQP－4的表達 見表2。在光鏡下AQP－4陽性細胞胞膜呈棕黃色深染，主要在大鼠腦干膠質(zhì)細胞、毛細血管的內(nèi)皮細胞及神經(jīng)元細胞表達。假損傷組AQP－4蛋白微弱表達，只有少量陽性細胞。DAI后6h AQP－4免疫組化染色程度即較對照組有顯著升高，在DAI后1d AQP－4免疫組化染色程度最強。隨著損傷后時間的推移，AQP－4免疫組化染色程度逐漸減弱，DAI后3d及5d仍顯著高于對照組。直至DAI后7d其免疫組化染色程度與對照組無明顯差異（P＞0．05），表2、圖1。另外，經(jīng)高壓氧治療后，DAI大鼠腦干部位的AQP－4表達程度有不同程度的下降。6h、1d、3d、5d組免疫組化評分，與同時間點

DAI組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05），表2、圖2。

表2 假損傷組、DAI組、HBO治療組大鼠腦干AQP－4免疫組化評分結(jié)果（）

表2 假損傷組、DAI組、HBO治療組大鼠腦干AQP－4免疫組化評分結(jié)果（）

注：與假損傷組比較＊P＜0．05；與同一時間點DAI組比較 △P＜0．05

組 別 6h 1d 3d 5d 7d DAI組 7．90±0．33＊* 9．72±0．61＊ 7．43±0．42＊ 7．31±0．53＊ 6．77±0．86治療組 6．85±0．35△ 8．02±0．41△ 6．28±0．31△ 6．63±0．37△ 6．18±0．38假損傷組 6．31±0．43

圖1 DAI組大鼠腦干AQP－4免疫組化（40×）

圖2 治療組大鼠腦干AQP－4免疫組化（40×）

討 論

本實驗使用劉曉斌［5］的大鼠DAI模型裝置，該裝置是在Si mt h［8］、賀曉生［9］的 DAI模型裝置的基礎(chǔ)上研制而成，采用瞬間旋轉(zhuǎn)方式制成大鼠DAI模型。使用該裝置建立的體外動物模型與其他DAI模型比較有以下特點：①損傷方式均一，受力過程可控制及量化，因而具有良好的可重復(fù)性。而Dixon等［10］的液壓沖擊模型及Mar marou［11］的打擊負荷模型易并發(fā)明顯的腦挫裂傷及蛛網(wǎng)膜下腔出血；②此種模型的顱腦損傷方式與交通事故中顱腦損傷的力學(xué)機制基本一致，復(fù)制出的動物模型具有明顯的意識障礙這一重要臨床特征。在賀曉生采用相似模型的研究中大鼠頭顱旋轉(zhuǎn)致DAI在病理變化上集中在腦干內(nèi)。因此選擇DAI大鼠腦干作為研究對象具有一定代表性。

AQP－4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布很廣，是含量最高的水通道蛋白。通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，AQP－4蛋白在星型膠質(zhì)細胞和室管膜細胞內(nèi)表達豐富，特別是在毛細血管內(nèi)皮細胞及與軟腦膜接觸的膠質(zhì)細胞膜，根據(jù)它的分布規(guī)律，推測它可能與水代謝和調(diào)節(jié)有很密切的關(guān)系［12］。Manley等［13］在急性水中毒腦水腫動物模型中發(fā)現(xiàn)，AQP－4在該模型的腦組織內(nèi)表達增強；在缺血性腦水腫模型中，應(yīng)用基因敲除技術(shù)使AQP－4在腦組織的表達缺乏，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺乏AQP－4的大鼠生存能力較野生型大鼠強，且腦內(nèi)水的容量及星形細胞周圍毛細血管水腫也明顯減輕，說明AQP－4參與了腦水腫的形成，并在其中起重要作用。Kiening等［14］觀察到壓縮氣體致大鼠腦沖擊損傷24 h后腦水腫達高峰，而AQP－4 mRNA表達隨時間延長而降低，在損傷半球降低更為顯著，AQP－4 mRNA下調(diào)可減少水在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的進一步積聚。

在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)大鼠DAI后出現(xiàn)腦干區(qū)的損傷，表現(xiàn)為腦干含水量增加，在傷后6h開始出現(xiàn)腦干水腫，傷后第1d達水腫高峰，此后腦干水腫持續(xù)，但水腫程度逐漸減退，至傷后第5d仍高于假損傷組。同時腦干區(qū)AQ4表達在傷后也呈現(xiàn)先增高后減低的過程，高峰也出現(xiàn)在傷后第1天，此后漸減低，第5天AQP－4的表達仍高假損傷組。在多個腦水腫試驗中，由于研究方法、手段、觀測時間等的不同，關(guān)于AQP－4在外傷性腦水腫中的作用，結(jié)論并不一致。通過本實驗可發(fā)現(xiàn)腦干水腫與AQP－4的表達有很強的相關(guān)性。

已有實驗表明HBO通過使頸動脈系統(tǒng)收縮，使腦血流下降，這樣便有效地降低了顱內(nèi)壓。有實驗證明，0．2 MPa的HBO使腦血流減少21%，顱內(nèi)壓降低36%；0．3 MPa的HBO可使腦血流減少25%，顱內(nèi)壓降低40%［15］。所以HBO既能在腦血流減少的情況下，降低顱內(nèi)壓，又能改善供氧。

通過本實驗將DAI組與HBO治療組比較發(fā)現(xiàn)，各時間點治療組腦干含水量均較DAI組明顯減少，AQP－4的表達亦較DAI組明顯減低。說明高壓氧治療對減輕腦干水腫有效。同時高壓氧治療能抑制AQP－4表達。因此，高壓氧治療腦外傷促進神經(jīng)功能恢復(fù)的機制之一有可能是通過減少AQP－4蛋白表達來抑制腦干水腫的發(fā)生，從而減輕了繼發(fā)性神經(jīng)損傷，保護神經(jīng)元結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，維持神經(jīng)元功能，并起到促進網(wǎng)狀激活系統(tǒng)功能恢復(fù)，促進清醒的作用。對于高壓氧治療是通過何種分子機制抑制AQP－4的表達，進而減輕腦水腫還需要我們通過的進一步實驗探索和發(fā)現(xiàn)。

［1］Meythaler JM，Peduzzi JD，Eleftheriou E，et al．Current concepts：diff use axonal injury associated trau matic brain injur y［J］．Arch Phys Med Rehabil，2001，82（10）：1461－1471．

［2］Sun MC，Honey CR，Berk C，et al．Regulation of aquaporin－4 in a trau matic brain injury model in rats［J］．Neurosurg，2003，98（3）：565－569．

［3］王 強，王湘渝，張香菊，等．高壓氧對創(chuàng)傷性腦水腫腦組織單胺遞質(zhì)變化的影響［J］．中國臨床康復(fù)，2004，8（34）：7729－7731．

［4］澤 芳，謝 鵬，牟 君，等．高壓氧對大鼠局灶性腦缺血再灌注腦線粒體能量代謝的影響［J］．重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，29（2）：138－140．

［5］劉曉斌，宋錦寧，陳景宇，等．腦彌漫性軸索損傷實驗裝置的研制及動物模型的建立［J］．西安交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2008，29（05）：595－598．

［6］Hellal F，Bonnefont－Rousselot D，Cr oci N，et al．Patter n of cerebral ede ma and hemorr hage in a mice model of diff use brain injur y［J］．Neuroscience Letters，2004，357（1）：21－24．

［7］Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al．COX－2 is expressed in hu man pul monar y，colonic，and ma mmar y tu mors［J］．Cancer，2000，89（12）：2637－2645．

［8］Smith DH，Chen XH，Xu B，et al．Characterization of diff use axonal pathology and selective hippocampal damage of following inertial brain trau ma in the pig［J］．J Neur opathol Exp Neurol，1997，56（7）：822－834．

［9］賀曉生，易聲禹，章 翔，等．腦彌漫性軸索損傷致傷裝置的研制和應(yīng)用［J］．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1998，19（1）：8789．

［10］Dixon CE，Lycth BG，Povlishock JT，et al．A fluid pcrcuslion model of experi mental brain injury in the rat［J］．J Neurosur g，1987，67（1）：110－119．

［11］Lighthall JW．Controlled cortical i mpact：a new experimental brain injury model［J］．J Neurotrau ma，1988，5（1）：1－15．

［12］Rash JE，Yasurnura T，Hudson C S，et al．Direct i mmunogold labeling of aquaporin－4 in square arrays of astr ocyte and ependy moeyte Plas ma membranes in rat brain and spinalcor d［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（20）：11951－119861．

［13］Manley GT，F(xiàn)uji mura M，Ma T，et al．Aquaporin－4 deletion in mice reduces brain edema after acute water in－toxication and ischemic stroke［J］．Nat Med，2000，6（2）：159－163．

［14］Kiening KL，van Landeghem FK，Schreiber S，et al．Decreased hemispheric aquaporin －4 is linked to evolvingbrain edema following controlled cortical i mpact injur y inrats［J］．Neurosci Lett，2002，324（2）：105－108．

［15］高春錦，楊捷云編著．實用高壓氧學(xué)［M］．北京：學(xué)苑出版社，1997：30－40．