王巧俠，李文凡，成 軍

1.西安市中心醫(yī)院感染科，陜西 西安 710003;2.甘肅省人民醫(yī)院消化科;3.北京地壇醫(yī)院傳染病研究所

丙型肝炎病毒(HCV)是慢性肝炎的主要致病因子之一，全世界約有一億七千萬人受到感染，HCV的感染很容易持續(xù)存在，造成肝臟慢性炎癥，導(dǎo)致肝臟纖維化以及肝硬化。目前認(rèn)為，HCV 進(jìn)入肝細(xì)胞后，病毒基因組及其編碼的蛋白與肝細(xì)胞基因與蛋白之間的相互作用，是決定HCV 復(fù)制、表達(dá)、免疫逃逸、慢性感染、肝纖維化以及致HCC(肝細(xì)胞肝癌)的關(guān)鍵因素之一［1］。其中核心蛋白作為一種多功能蛋白質(zhì)，能夠影響多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活多種病毒及細(xì)胞基因啟動子，調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄［2］。基于以往的研究成果，我們推測HCV 核心蛋白可能參與了細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的調(diào)控，從而影響著肝纖維化、肝硬化的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過觀察HCV 核心蛋白對TIMP-1表達(dá)的影響，以探討HCV 核心蛋白的致肝纖維化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系HepG2 細(xì)胞、人肝星狀細(xì)胞系LX-2 細(xì) 胞、PcDNA3.1 (－)-HCVcore 質(zhì) 粒、pCAT3-TIMP-1P 質(zhì)粒及大腸桿菌DH 5α 菌株為北京地壇醫(yī)院傳染病研究所保存。Tag DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶及限制性內(nèi)切酶均購自Takara 公司。質(zhì)粒DNA 提取試劑盒，中間載體pGEM-Teasy及報(bào)告質(zhì)粒pCAT3-Basic 均購自Promega 公司;CAT-ELISA 檢測試劑盒及質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染試劑盒購自Roche 公司。玻璃奶純化試劑盒購自博大公司，其他生化試劑購自Sigma 公司。DNA 序列測定由上海諾華公司完成。

1.2 pCAT3-TIMP-1 報(bào)告載體的構(gòu)建 根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］，設(shè)計(jì)合成一對寡核苷酸引物，上游引物P1:5'-GCTAGCAGAACCGGTACCCATCTCAG-3'。下游引物P2:5'-CTCGAGCTGTACCTCTGGTGTCTCTC-3'，在上下游引物的5'-端分別引入NheI和XhoI 單一酶切位點(diǎn)(劃線部分)，以HepG2 細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增TIMP-1 基因啟動子DNA 片段。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min、65℃褪火1 min、72℃延伸1 min，循環(huán)35次，72℃保溫10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果。玻璃奶法回收純化PCR 產(chǎn)物?；厥债a(chǎn)物與pGEM-Teasy中間載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α 大腸桿菌，挑取在含有氨芐西林鈉的選擇平皿上生長的白色菌落提取質(zhì)粒。酶切(KpnⅠ/MluⅠ)鑒定后，Kpn Ⅰ/Mlu Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒pGEMTeasy-TIMP-1P，玻璃奶純化回收酶切產(chǎn)物，DNA測序鑒定無誤后定向克隆至pCAT3-basic 載體，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCAT3-TIMP-1p，經(jīng)NheI和XhoI 雙酶切鑒定。磁珠法提取質(zhì)粒以備轉(zhuǎn)染。

1.3 pCAT3-TIMP-1 報(bào)告載體轉(zhuǎn)錄活性的鑒定 在35 mm 培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞，細(xì)胞生長至50%～80%融合時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCAT3-TIMP-1P 1μg，同時(shí)以轉(zhuǎn)染pCAT3-basic的HepG2 細(xì)胞作陰性對照，以轉(zhuǎn)染pCAT3-promoter的HepG2 細(xì)胞作陽性對照。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞裂解液，用于CAT 活性檢測。

1.4 CAT 表達(dá)水平的檢測 按照試劑盒說明書進(jìn)行。取1.0 ng/ml的CAT 標(biāo)準(zhǔn)品(試劑盒提供)及細(xì)胞裂解液200μl 加入已包被抗體的96 孔板中，37℃溫育1 h，再依次加入第一抗體(地高辛標(biāo)記的抗-CAT)、第二抗體(偶聯(lián)有過氧化物酶的地高辛抗體anti-DIG-POD)各200μl，37℃溫育1 h 后，加入過氧化物酶的底物室溫顯色10～30 min。用酶標(biāo)儀測量標(biāo)本在波長415 nm 處的吸光度值，其數(shù)值反映細(xì)胞提取物中的CAT 表達(dá)水平。以未作轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解液作空白對照進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。

1.5 pCAT3-TIMP-1P 與PcDNA3.1(－)-HCVcore質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) pCAT3-TIMP-1P、PcDNA3.1(－)-HCVcore各1μg 以脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染LX-2 細(xì)胞，同時(shí)以轉(zhuǎn)染pCAT3-basic的LX-2 細(xì)胞作陰性對照，以轉(zhuǎn)染pCAT3-promoter的LX-2 細(xì)胞作陽性對照。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞裂解液，檢測CAT 活性。所有實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格平行操作。

2 結(jié)果

2.1 pCAT3-TIMP-1P 重組質(zhì)粒的鑒定 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示擴(kuò)增片段約800 bp(見圖1)。DNA 測序結(jié)果與基因庫中TIMP1 啟動子序列比對，擴(kuò)增片段位于TIMP-1 啟動子974～1774 bp。構(gòu)建的pCAT3-TIMP-1p 重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α 細(xì)菌后，進(jìn)行菌落PCR，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示擴(kuò)增片段約為800 bp，符合預(yù)期大小，無非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。提取的質(zhì)粒應(yīng)用NheI和XhoI酶切鑒定，結(jié)果表明TIMP-1P DNA 與pCAT3-Basic 報(bào)告基因載體正確連接(見圖2)。

圖1 TIMP-1p PCR 擴(kuò)增 M:2 000 bp marker;1:TIMP-1p PCR 產(chǎn)物;圖2 Pcat3-TIMP-1p 雙酶切鑒定(NheI/XhoI)Fig 1 TIMP-1p PCR amplification M:2 000 bp marker;1:TIMP-1p PCR product;Fig 2 Idengified Pcat3-TIMP-1p by NheI/XhoI

2.2 pCAT3-TIMP-1P 啟動子活性的鑒定 pCAT3-TIMP-1p 轉(zhuǎn)染入HepG2 細(xì)胞后，以ELISA 法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示pCAT3-basic的吸光度值為0.004±0.002，pCAT3-promoter為2.029±0.650，pCAT3-TIMP-1p為2.329±0.685，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.075，P＜0.05)，LSD 法兩兩比較均顯示P＜0.05，提示pCAT3-TIMP-1p 在HepG2 細(xì)胞中能夠啟動CAT的表達(dá)，具有較強(qiáng)的啟動子活性(見表1)。

表1 Pcat3-TIMP-1p 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2的CAT 吸光度值Tab 1 The OD of Pcat3-TIMP-1p after transfecting HepG2

2.3 PcDNA3.1(－)-HCVcore 與pCAT3-TIMP-1p共轉(zhuǎn)染后報(bào)告基因CAT 表達(dá)活檢的檢測 PcDNA3.1(－)-HCVcore 與pCAT3-TIMP-1p 共轉(zhuǎn)染LX-2 細(xì)胞后，pCAT3-TIMP-1p 吸光度值為0.833±0.040，同期單獨(dú)轉(zhuǎn)染LX-2 細(xì)胞的pCAT3-TIMP-1p 吸光度值為0.677± 0.049，pCAT3-basic為0.193± 0.090，pCAT3-promoter為0.354±0.052，方差分析F=132.401(P＜0.05)，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)，LSD 法兩兩比較均顯示P＜0.05，提示PcDNA3.1(－)-HCVcore與pCAT3-TIMP-1p 共轉(zhuǎn)染后，pCAT3-TIMP-1p的表達(dá)增加(見表2)。說明HCV 核心蛋白能夠上調(diào)TIMP-1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。

表2 PcDNA3.1(－)-HCVcore 與pCAT3-TIMP-1p 共轉(zhuǎn)染LX-2的CAT 吸光度值Tab 2 The OD of PcDNA3.1(－)-HCVcore and Pcat3-TIMP-1p cotransfect LX-2

3 討論

肝纖維化和肝硬化是連續(xù)的發(fā)展過程。在致病因子的作用下由于肝臟的持續(xù)炎癥活動，肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展破壞了正常的小葉結(jié)構(gòu)，假小葉和再生結(jié)節(jié)形成，則進(jìn)入肝硬化。阻斷、抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化是治療慢性肝病的重要目標(biāo)之一。因此，研究肝纖維化和肝硬化的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制有著深遠(yuǎn)的意義。

肝纖維化發(fā)生的始動步驟在于肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活。HSC 激活后，一方面通過增殖使細(xì)胞數(shù)量增加;另一方面單個HSC 合成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的能力增強(qiáng)，使ECM的量和質(zhì)均發(fā)生顯著變化。以膠原為主的ECM 成份可較正常肝增加3～8 倍;各型膠原之間、糖蛋白之間及蛋白多糖之間的比值也出現(xiàn)異常［4］。而肝臟ECM的代謝主要由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其天然抑制劑-TIMPs 調(diào)節(jié)，MMPs 幾乎能降解ECM的所有成分，而TIMPs 通過與MMPs 成員結(jié)合成復(fù)合物而抑制其活性，阻止ECM的降解，從而形成和促進(jìn)肝纖維化。在肝纖維化早期，MMPs 酶解活性較為活躍，持續(xù)地降解正常基底膜，破壞肝臟的正常結(jié)構(gòu)。ECM的成份和三維空間結(jié)構(gòu)的改變又進(jìn)一步刺激HSC 活化，調(diào)節(jié)HSC的形態(tài)、增殖及膠原合成［5］，并使HSC 持續(xù)激活并維持活化狀態(tài)。隨著肝纖維化的發(fā)展，HSC 完全活化，大量合成ECM和TIMPs，TIMPs 進(jìn)行性升高，與MMPs 特異性結(jié)合，使后者酶解活性顯著下降，基質(zhì)降解被抑制，ECM 在細(xì)胞外沉積增加，形成纖維化［6］。因而，學(xué)者們認(rèn)為TIMPs 是肝纖維化發(fā)展過程中的一個非常重要的促進(jìn)因素［7］，目前在肝臟中主要有TIMP-1、TIMP-2 表達(dá)。TIMP-1可以結(jié)合除MMP-14、MMP-19 以外的所有MMP，并使其活性減弱，主要是抑制MMP-1的活性，TIMP-1可與MMP-1 酶原非催化位點(diǎn)結(jié)合，抑制酶原的活化。同時(shí)TIMP-1可與活化的MMP-1、MMP-3 形成復(fù)合物抑制兩者的活性，還能以非共價(jià)鍵形式與明膠酶原結(jié)合，抑制明膠酶原自活化，與明膠酶原結(jié)合的TIMP-1 仍可抑制MMP-1的活性。研究發(fā)現(xiàn)肝組織內(nèi)TIMP-1 水平與肝組織炎癥和肝纖維化程度密切相關(guān)，在正常肝組織中既有表達(dá)，隨著肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展表達(dá)逐漸增強(qiáng)，而隨著纖維的自然消散則迅速下降［8］。因此，研究抑制TIMP-1 繼續(xù)活化的方法成為近年來治療肝纖維化的突破點(diǎn)之一［9］。

HCV 是一個由脂膜包裹的正鏈RNA 病毒。根據(jù)所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，其基因組分為結(jié)構(gòu)基因(structural gene)和非結(jié)構(gòu)基因(unstructural gene)。大量的研究表明HCV 核心蛋白具有廣泛的反式調(diào)節(jié)作用，并參與肝纖維化的發(fā)生。那么HCV 核心蛋白對TIMPs的表達(dá)是否同樣具有調(diào)節(jié)作用?是否HCV的核心蛋白通過對TIMPs 表達(dá)的影響而參與了肝纖維化向肝硬化的發(fā)展?這一假設(shè)的提出，要求我們從DNA水平或轉(zhuǎn)錄水平去研究HCV 核心蛋白對TIMPs 表達(dá)的影響。本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將PcDNA3.1(－)-HCVcore 與pCAT3-TIMP-1p 共同轉(zhuǎn)染入人肝星狀細(xì)胞系LX-2中，同時(shí)分別設(shè)立陰性對照組和陽性對照組。采用ELISA 法檢測各個細(xì)胞組CAT 表達(dá)的差異，結(jié)果顯示PcDNA3.1(－)-HCVcore 與pCAT3-TIMP-1p 共同轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組，其CAT 表達(dá)明顯高于同期單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCAT3-TIMP-1p的細(xì)胞組，方差分析提示各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LSD 法比較均顯示兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PcDNA3.1(－)-HCVcore 與pCAT3-TIMP-1p 共轉(zhuǎn)染后，pCAT3-TIMP-1p的表達(dá)增加。因而得出結(jié)論，HCV 核心蛋白通過激活TIMP-1啟動子的活性而上調(diào)TIMP-1的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了HCV 引起肝纖維化和肝硬化的可能分子機(jī)制。從另一個角度闡明了經(jīng)過積極抗病毒治療的患者，他們的肝臟解剖結(jié)構(gòu)可以改善、逆轉(zhuǎn)的原因。

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