李金鵬，于紅剛

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060

Notch 是一條在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)通路，參與多種細(xì)胞內(nèi)分子生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變、分化、增殖、血管生成和上皮細(xì)胞間葉樣轉(zhuǎn)變等［1］。磷酸肌醇3/激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路在多種癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，蛋白激酶B (Akt)的活化位于PI3K 超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的下游，主要負(fù)責(zé)由PI3K 始動(dòng)的生物信息的傳導(dǎo)，處于這一通路的中心環(huán)節(jié)［2］。研究發(fā)現(xiàn)Notch 通路和PI3K/Akt 通路存在著相互作用，共同參與細(xì)胞的分子生物學(xué)行為［3-5］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用上述兩個(gè)信號(hào)通路的特異性抑制劑GSI和LY294002 來(lái)探討其在胃癌細(xì)胞系SGC-7901中的作用及影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:胃癌SGC-7901 細(xì)胞系由消化疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.1.2 試劑:RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO 生物技術(shù)公司;磷酸化Akt 抗體、Notch-1 抗體以及相關(guān)二抗試劑盒均為CST 公司進(jìn)口原裝產(chǎn)品;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和抑制劑GSI 均購(gòu)自美國(guó)的Sigma 公司;LY294002 來(lái)源于美國(guó)的Alex 公司;提取總蛋白試劑盒及Western blotting 所需的其他試劑來(lái)源于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):傳代培養(yǎng)胃癌SGC-7901 細(xì)胞于含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中。6%CO2濃度、37℃培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖:用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液將貼壁細(xì)胞配成單個(gè)細(xì)胞懸液，濃度為10 000～20 000/ml，每孔體積200μl 細(xì)胞接種到96 孔板，細(xì)胞貼壁后即加藥。每種處理設(shè)5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組(不加藥物處理)、LY294002組、GSI組、聯(lián)合處理組共20個(gè)實(shí)驗(yàn)孔。LY294002 2 mg/ml(該濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)［2］)，每5個(gè)孔加10μl，GSI 20 mg/ml(該濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)［6］)，每5個(gè)孔加1μl。聯(lián)合組藥物用量同單用組。藥物均混勻于無(wú)血清培養(yǎng)基后再加入到相應(yīng)孔中。作用24 h 后，每孔加MTT［3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽］溶液(5 mg/ml 用PBS 配制，pH=7.4)10μl 繼續(xù)孵育4 h 后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加100μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇OD490 nm波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果并計(jì)算細(xì)胞抑制率=(空白組吸光度值均值－各濃度組吸光度值均值/空白組吸光度值均值)×100%，并繪制直方圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 六孔板加藥處理:對(duì)照組設(shè)1個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)組LY294002(2 mg/ml)10μl 處理2個(gè)孔，GSI(20 mg/ml)1μl 處理1個(gè)孔和兩者聯(lián)合(同上濃度同體積)處理2個(gè)孔。以細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%孔域并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始加藥，作用24 h 后提取各組總蛋白，行Western blotting 檢測(cè)各組磷酸化的Akt和Notch-1 水平(以β-Actin 蛋白為內(nèi)參對(duì)照)。步驟包括提取并測(cè)定總蛋白濃度、計(jì)算20μg 體積下的上樣量、蛋白電泳、纖維膜電轉(zhuǎn)和X 光膠片顯影等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料兩組間比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制劑作用后可抑制癌細(xì)胞的增殖 Notch和PI3K/Akt 兩條信號(hào)通路的抑制劑GSI和LY294002 均能抑制胃癌SGC-7901 細(xì)胞的增殖，抑制增殖率分別為(53.56±2.04)%和(42.93±1.64)%，且二者聯(lián)合應(yīng)用癌細(xì)胞的增殖率降低更明顯，為(86.01±2.02)%(見(jiàn)圖1)。GSI和LY294002 單獨(dú)處理組分別與抑制劑聯(lián)合處理組抑制率的兩兩配對(duì)t 檢驗(yàn)，得出tGSI=－41.12 (P=0.00)、tLY294002=－89.72 (P=0.00)。

圖1 各處理組胃癌細(xì)胞增殖抑制率Fig 1 Cells proliferation inhibition rate of each treated group

2.2 抑制劑作用后可降低Notch-1和p-Akt的表達(dá)水平 Notch 信號(hào)通路的抑制劑GSI 能降低蛋白Notch-1的表達(dá)水平，而p-Akt的表達(dá)水平則較對(duì)照組增加;PI3K/Akt 通路的抑制劑LY294002 能降低p-Akt的表達(dá)水平，Notch-1 水平則無(wú)明顯變化;兩種信號(hào)通路的抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后，p-Akt和Notch-1 蛋白的表達(dá)水平均降低(見(jiàn)圖2)。

圖2 抑制劑作用后Notch-1和p-Akt的表達(dá)水平 A:GSI可降低Notch-1的表達(dá)水平;B:LY294002可降低p-Akt的表達(dá)水平;C:抑制劑聯(lián)合處理后可同時(shí)降低Notch-1和p-Akt的表達(dá)Fig 2 Expression level of Notch-1 and p-Akt after treated by inhibitors A:GSI could reduce the expression of Notch-1;B:LY294002 could reduce the expression level of p-Akt;C:Combination of inhibitors could reduce both expression of Notch-1 and p-Akt simultaneously

3 討論

Notch 基因通過(guò)編碼跨膜受體而誘發(fā)多級(jí)生物級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而參與諸如細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變、分化、增殖、血管生成、細(xì)胞遷移和上皮細(xì)胞間葉樣變等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程［1，3］。它包括四個(gè)受體(Notch-1，2，3，4)和五種配體(jagged-1，jagged-2，Delta 樣受體1、3、4)。當(dāng)細(xì)胞上的Notch 受體與鄰近細(xì)胞上的Notch 配體結(jié)合后，Notch通路即被激活［6］。激活的Notch 蛋白在金屬蛋白酶腫瘤壞死因子-α 轉(zhuǎn)化酶(TACE)和γ-分泌酶復(fù)合物(γsecretase complex)的蛋白水解下，釋放其細(xì)胞內(nèi)部分ICN，當(dāng)ICN 進(jìn)入細(xì)胞核后活化Notch-CSL 復(fù)合物，則進(jìn)一步調(diào)控多個(gè)下游靶基因的表達(dá)。如果采用γ-分泌酶復(fù)合物的抑制劑GSI 則能阻斷上述過(guò)程［7］。

PI3K/Akt 通路在多種癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，Akt的活化位于PI3K 超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的下游，主要負(fù)責(zé)由PI3K 始動(dòng)的生物信息的傳導(dǎo)，處于這一通路的中心環(huán)節(jié)。采用特異性抑制劑降低其下游磷酸化Akt的水平，從而阻斷Akt的磷酸化活化及其下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而阻斷PI3K 通路的生物學(xué)效應(yīng)［2］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Notch 信號(hào)通路的抑制劑GSI和PI3K/Akt 信號(hào)通路的抑制劑LY294002 分別單獨(dú)和聯(lián)合處理胃癌SGC-7901 細(xì)胞。MTT和Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Notch 信號(hào)通路的抑制劑GSI 能抑制癌細(xì)胞的增殖，降低蛋白Notch-1的表達(dá)水平，而p-Akt的表達(dá)水平則較對(duì)照組增加。LY294002 能抑制癌細(xì)胞的增殖，并降低p-Akt的表達(dá)水平，Notch-1 水平則無(wú)明顯變化，兩種信號(hào)通路的抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后能明顯降低癌細(xì)胞的增殖率，p-Akt和Notch-1 蛋白的表達(dá)水平均降低。這就提示Notch 信號(hào)通路被抑制后PI3K/Akt信號(hào)通路被某種程度的上調(diào)，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用PI3K/Akt 通路抑制劑抑制該通路，兩條通路均被抑制，癌細(xì)胞的增殖抑制率則更明顯，提示中間存在某個(gè)共同的環(huán)節(jié)聯(lián)系這兩條通路。國(guó)外學(xué)者［3-5］在急性淋巴細(xì)胞白血病T 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，Notch 信號(hào)途徑能夠激活Pten基因，而該基因的激活能下調(diào)PI3K/Akt 通路的活性。如果Notch 被其抑制劑GSI 抑制，則Pten 基因也被相應(yīng)地抑制，解除了對(duì)PI3K/Akt的下調(diào)，表現(xiàn)為Akt 磷酸化活性的增高。如果抑制Notch的同時(shí)抑制PI3K/Akt，則癌細(xì)胞的抑制率明顯增加，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。

國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)胃癌SGC-7901 細(xì)胞呈中度表達(dá)Pten 基因［8-9］。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測(cè)，Notch 信號(hào)通路在胃癌SGC-7901 細(xì)胞系中可能通過(guò)Pten 基因與PI3K/Akt 通路相聯(lián)系，Notch 調(diào)控Pten，而Pten 調(diào)控PI3K/Akt，共同參與胃癌SGC-7901 細(xì)胞系的分子生物學(xué)過(guò)程。兩信號(hào)通路間可能還有其他的分子間作用聯(lián)系，有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和研究。

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