劉桂英楊立業(yè)李文玉鄭佳坤陳輝陳強(qiáng)

脂肪組織來源的干細(xì)胞體外培養(yǎng)隨機(jī)惡性轉(zhuǎn)化

劉桂英1楊立業(yè)2,3★李文玉2鄭佳坤3陳輝2陳強(qiáng)2

目的 研究脂肪來源干細(xì)胞在體外能否惡性轉(zhuǎn)化。 方法 從小鼠脂肪組織培養(yǎng)出脂肪組織來源干細(xì)胞（ADSCs），觀察細(xì)胞是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，并對(duì)其染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并將轉(zhuǎn)化細(xì)胞移植到裸鼠皮下以檢測(cè)其成瘤性。 結(jié)果 1個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞在體外培養(yǎng)4個(gè)月左右發(fā)生了轉(zhuǎn)化，已經(jīng)永生化，目前體外培養(yǎng)超過100代，細(xì)胞仍維持原來的增殖速度。細(xì)胞表達(dá)中胚層的標(biāo)志物vimentin，但不表達(dá)pan-CK，說明其是間充質(zhì)來源；同時(shí)表達(dá)PCNA、Ki67和VEGF-c，不表達(dá)p16；染色體分析證明為非整倍體，有廣泛的易位；透射電鏡下可見細(xì)胞表面微絨毛結(jié)構(gòu)；細(xì)胞在軟瓊脂中沒有克隆形成能力；裸鼠皮下移植能夠形成腫瘤組織，腫瘤組織的主體成分為肉瘤。 結(jié)論 脂肪組織來源的干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)能夠發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，裸鼠皮下移植能夠形成肉瘤。

肉瘤；脂肪組織來源干細(xì)胞；惡性轉(zhuǎn)化；干細(xì)胞；永生化

體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞是研究腫瘤生物學(xué)特性、癌變機(jī)理和癌癥治療的良好生物學(xué)模型，細(xì)胞系的建立允許詳細(xì)分析生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、抗原性和細(xì)胞原性的特征。傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞系建立方法是應(yīng)用獲得的腫瘤組織進(jìn)行培養(yǎng)，或者將外源性的基因?qū)爰?xì)胞，如端粒酶基因[1]、SV40大T抗原[2]、myc基因[3]和Ras基因等[4]，細(xì)胞才能長(zhǎng)期存活，獲得不死性。

脂肪組織中存在干細(xì)胞，稱為脂肪組織來源的干細(xì)胞（adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）在體外可以長(zhǎng)期培養(yǎng)，具有多種方向的分化能力，是組織工程研究中的一種重要的種子細(xì)胞[5]。我們對(duì)小鼠的ADSCs進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，觀察細(xì)胞能否惡性轉(zhuǎn)化，及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后的特性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Balb/C小鼠購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，Balb/C裸鼠購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 ADSCs分離培養(yǎng)

采用頸椎脫臼法處死Balb/C小鼠，以750 mL/L乙醇浸泡5 min；無(wú)菌條件下取其腹膜外脂肪組織，用緩沖液反復(fù)沖洗，剪刀剪碎，0.125% 膠原酶，37℃消化45 min，在消化過程中用吸管反復(fù)吹打，1 500 r/min離心10 min，最上層為成熟的脂肪組織，棄去脂肪組織和上清，沉淀成分為基質(zhì)血管層（stromal vascular fraction，SVF），160 mmol/L的NH4Cl裂解SVF中的紅細(xì)胞10 min，離心棄上清；DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，篩網(wǎng)過濾離心，棄上清。DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，培養(yǎng)基中含有2 mmol/L 谷氨酰胺、10%的胎牛血清（FBS）、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素，種植于培養(yǎng)瓶中，密度約為8 000～20 000個(gè)/mL，放入37℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后倒掉原來的培養(yǎng)基，去除未貼壁的紅細(xì)胞和殘?jiān)?，剩余貼壁細(xì)胞能夠增殖、傳代即為ADSCs。每 2～3 d換液一次， 約 7～10 d細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，0.25%胰酶消化傳代[5,6]。

1.3 細(xì)胞系的維持、凍存與復(fù)蘇

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶和0.02% EDTA消化細(xì)胞5 min，收集細(xì)胞，1 000 rpm離心5 min，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，1瓶細(xì)胞分種2瓶，同時(shí)凍存適量細(xì)胞，凍存液為培養(yǎng)液，含有10%二甲基亞砜，放入液氮罐中或超低溫冰箱中保存。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，將盛有細(xì)胞的冷凍管從液氮或超低溫冰箱中取出，37℃水浴，使細(xì)胞融化、離心、棄上清，將預(yù)溫至37℃、含有10%血清的培養(yǎng)液加入離心管中重懸細(xì)胞，置于37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察

1.4.1 染色

將細(xì)胞接種于放有蓋玻片的小平皿中，長(zhǎng)成單層，經(jīng)PBS洗滌后，用4%多聚甲醛固定，做常規(guī)HE染色及免疫組化染色。

1.4.2 電子顯微鏡

將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，接種后第2天，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化，離心，沉淀的細(xì)胞團(tuán)用2.5%戊二醛及1%鋨酸雙固定，Epon 812包埋，超薄切片，染色，在JEM-1010透射電鏡下觀察（吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡室）。

1.5 軟瓊脂細(xì)胞克隆形成

采用雙層瓊脂糖培養(yǎng)法，先將1%瓊脂糖與預(yù)溫至37℃的2×DMEM等體積混合均勻，澆入75 mL培養(yǎng)瓶中，5 mL/瓶，置室溫使瓊脂凝固；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，與1%瓊脂混合均勻，制備成含細(xì)胞的0.3%瓊脂培養(yǎng)基，澆入鋪有底層瓊脂的培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞濃度分別為100個(gè)/mL、1 000個(gè)/mL、10 000個(gè)/mL，將培養(yǎng)瓶移入CO2培養(yǎng)箱，置于37℃、5% CO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)，于2周左右計(jì)數(shù)集落形成率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.6 染色體分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入終濃度為0.04 μg/mL的秋水仙素，5% CO2、37℃孵育2 h，吸出培養(yǎng)液，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，離心1 500 rpm，8 min，棄上清，加入0.075 M KCl，37℃水浴20 min，離心棄上清，加入新鮮配制的固定液（甲醇∶冰醋酸 = 3∶1），室溫固定10 min，離心后棄上清，重復(fù)固定一次，滴片，室溫干燥，進(jìn)行Gemsa染色，計(jì)數(shù)100個(gè)分裂中期的染色體，進(jìn)行核型分析。

1.7 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

應(yīng)用SP法檢測(cè)pan-CK、SMA、vimentin、desmin、ferritin、VEGF-c、p16、Ki67和PCNA在細(xì)胞中的表達(dá)，AEC顯色，結(jié)果拍照留底。SP-9000試劑盒為北京中杉金橋公司產(chǎn)品，所有抗體由Santa Cruz公司產(chǎn)品（北京中杉金橋公司代理）。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次以上。設(shè)置陰性對(duì)照：用0.01 mol/L PBS替代一抗。

1.8 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（第37代細(xì)胞），制備成細(xì)胞懸液接種裸鼠，接種量1×106～2×106細(xì)胞/只，皮下接種裸鼠11只。觀察成瘤率、腫瘤潛伏期。在腫瘤接種后1～3個(gè)月，照相后處死，取出腫塊作病理組織學(xué)檢查。對(duì)所有裸鼠全身重要臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查，注意有無(wú)局部淋巴結(jié)及全身轉(zhuǎn)移。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的特點(diǎn)

原代培養(yǎng)的ADSCs約于接種數(shù)小時(shí)后逐漸貼壁，貼壁細(xì)胞初為類圓形，細(xì)胞大小不等，接種后24 h，體積較大的細(xì)胞很多已貼壁，并開始伸展，多呈梭形，少數(shù)細(xì)胞為多角形。1 周后，細(xì)胞漸達(dá)70%～80%融合。排列出現(xiàn)方向性，但有少量細(xì)胞由梭形漸變?yōu)闄E圓形、圓形。此時(shí)可按1∶2進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。傳代后細(xì)胞約于3～5 d可達(dá)85%融合，可再次進(jìn)行消化傳代。我們的前期研究證實(shí)，用這種方法獲得的ADSCs具有多向分化的能力[5～7]。

2.2 ADSCs的惡性轉(zhuǎn)化

我們共進(jìn)行了10次小鼠細(xì)胞的原代培養(yǎng)，8次原代培養(yǎng)成功，5例的細(xì)胞在體外培養(yǎng)不超過2個(gè)月，細(xì)胞就全部死亡；3次體外培養(yǎng)超過4個(gè)月的細(xì)胞中，有1次發(fā)生了細(xì)胞的自發(fā)轉(zhuǎn)化，發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的時(shí)間約在體外培養(yǎng)的第4個(gè)月，在培養(yǎng)瓶中發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞的一些特征：細(xì)胞體積顯著增大，可觀察到大量處于分裂中期的細(xì)胞，細(xì)胞增殖速度明顯加快，倍增周期明顯縮短，約為20 h，細(xì)胞呈無(wú)限生長(zhǎng)及增殖的態(tài)勢(shì)，且對(duì)血清的依賴性顯著下降，細(xì)胞極性及細(xì)胞間接觸抑制現(xiàn)象消失。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)pan-actin（圖1A）、vimentin（圖1B）和desmin（圖1C），部分細(xì)胞表達(dá)SMA（圖1D）；細(xì)胞也表達(dá)Ki67（圖2A）、PCNA（圖2B）、ferritin（圖2C）和VEGF-c（圖2D），pan-CK和p16在細(xì)胞中的無(wú)表達(dá)（未顯數(shù)據(jù)）。

2.4 細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡下可見：細(xì)胞大小均勻，呈圓形，表面可見微絨毛結(jié)構(gòu)，核呈圓形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞核明顯增大，多為單核，偶見2個(gè)核細(xì)胞，可見核分裂相，核膜可有內(nèi)陷或外凸，核的形態(tài)不規(guī)則，核異染質(zhì)增多，凝集成塊狀或聚集在核膜下，核仁增大，數(shù)目增多，形狀和位置不規(guī)則，細(xì)胞中可見較多脂滴樣結(jié)構(gòu)（圖3A）。

圖1 惡性轉(zhuǎn)化的ADSCs表達(dá)肌肉細(xì)胞的標(biāo)志物Figure 1 The malignantly transformed ADSCs were stained by muscle markers

圖2 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物Figure 2 Malignantly transformed ADSCs were positive for some tumor markers

圖3 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、染色體、裸鼠皮下成瘤和病理Figure 3 The ultrastructure of malignantly transformed ADSCs, chromosomes, tumorigenesis and pathology

2.5 軟瓊脂細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞在軟瓊脂中無(wú)克隆形成。

2.6 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的染色體為非整倍體

分析100個(gè)分離中期細(xì)胞（第37代細(xì)胞）染色體，所有的這些細(xì)胞均為非整倍體，染色體數(shù)目波動(dòng)在65～89之間，眾數(shù)為75～79條，眾數(shù)染色體占總數(shù)的50%，染色體可見雙著絲粒、環(huán)狀染色體、易位等結(jié)構(gòu)異常（圖3B）。

2.7 裸鼠皮下成瘤

11只裸鼠在接種細(xì)胞后的1個(gè)月內(nèi)，在注射部位都長(zhǎng)出了腫瘤，腫瘤逐漸增大，2個(gè)月左右直徑可達(dá)2 cm以上（圖3C），在腫瘤生長(zhǎng)的不同階段，用頸椎脫臼法處死裸鼠，從裸鼠皮下取出腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)腫瘤與周圍分界基本清楚。腫瘤為單發(fā)，實(shí)性，包膜較完整，未見小葉，表面有豐富的血管，切面灰白色，質(zhì)脆，腫瘤直徑小于1 cm時(shí)，中心無(wú)明顯壞死液化。種植超過3個(gè)月的腫瘤中心可見明顯的壞死灶；未見全身重要臟器及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。為鑒定腫瘤的具體性質(zhì),對(duì)各個(gè)腫瘤分別進(jìn)行了組織學(xué)分析。最終的結(jié)果表明，11個(gè)腫瘤均不同程度地呈現(xiàn)肉瘤的特征，胞核與胞漿比例增大，核染色質(zhì)細(xì)，散在分布，高度分化，可見病理性核分裂（圖3D）。免疫組織化學(xué)顯示細(xì)胞表達(dá)vimentin，為中胚層細(xì)胞來源。

3 討論

脂肪來源的干細(xì)胞目前也稱為脂肪組織來源的基質(zhì)細(xì)胞，它能分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞[5,6,10,11]，因此可用于組織工程的研究和應(yīng)用。最近有研究證明，骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)會(huì)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，移植到裸鼠體內(nèi)能夠形成腫瘤[7]。我們的前期研究證明，ADSCs在化學(xué)藥物的誘導(dǎo)下會(huì)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在體內(nèi)能夠形成多種肉瘤組織[9]。

我們對(duì)ADSCs進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可在體外發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。到目前為止，惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在體外已傳代近8年，傳代100次以上，細(xì)胞的形態(tài)趨于均一，細(xì)胞大小一致，生長(zhǎng)的速度相同，表達(dá)相同的標(biāo)志物，因此可以認(rèn)為細(xì)胞來源于1個(gè)單細(xì)胞克隆。染色體的分析證明，每個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)目是不相同的，這是由于長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生不同的染色體異常的積累所致，使腫瘤細(xì)胞異質(zhì)化，即長(zhǎng)期培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞個(gè)體之間可能有細(xì)微的差別。染色體數(shù)目波動(dòng)在65～89之間，75～79條染色體占總數(shù)的50%，細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，這些結(jié)果提示此細(xì)胞系具有惡性腫瘤細(xì)胞的特性。國(guó)內(nèi)史春夢(mèng)等[13]對(duì)大鼠的真皮來源的多能干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，也發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，并且建立了一株惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，認(rèn)為K-ras/mitogen-activated protein kinase（MAPK）激酶信號(hào)通路的過度激活在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞系在體外不表達(dá)p16基因，p16基因失活可能是ADSCs發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的一種關(guān)鍵的分子機(jī)制[12]。p16基因失活可能由于缺失、突變和啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化修飾所致，目前我們的初步研究證實(shí)是由于p16基因缺失所致（未顯數(shù)據(jù)）。ADSCs長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中染色體的改變或DNA的斷裂，也可能參與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的病理過程[14]。

在電鏡下觀察到腫瘤細(xì)胞表面有許多微絨毛和突起。研究表明，細(xì)胞表面的微絨毛和突起與細(xì)胞的粘附能力有關(guān)，生長(zhǎng)于膠原凝膠表面的細(xì)胞，借助這些微絨毛粘附于膠原纖維；并且微絨毛的數(shù)量和排列與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。透射電鏡下見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，核膜凹陷或突起，核漿比例失調(diào)，符合腫瘤細(xì)胞的特征。

免疫細(xì)胞化學(xué)研究證明，細(xì)胞表達(dá)肌肉細(xì)胞的標(biāo)志物desmin和actin，同時(shí)細(xì)胞表達(dá)中胚層的標(biāo)志物vimentin。因此可以認(rèn)為此細(xì)胞系來源的是中胚層。細(xì)胞系不具有軟瓊脂克隆形成能力，證明細(xì)胞的惡性程度較低，這與裸鼠皮下移植的無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和病理表現(xiàn)相一致。至今為止，我們應(yīng)用體外培養(yǎng)技術(shù)對(duì)ADSCs進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，建立了惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，通過對(duì)該細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及生物學(xué)特性的觀察，證實(shí)是惡性細(xì)胞系，此細(xì)胞系可用于肉瘤的基礎(chǔ)研究。

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Adipose tissue-derived stem cells transform malignantly in vitro spontaneously

LIU Guiying1, YANG Liye2,3★, LI Wenyu2, ZHENG Jiakun3, CHEN Hui3, CHEN Qiang2
(1.Department of Stomatology, Chaozhou Central Hospital, Guangdong, Chaozhou 521021, China; 2.Laboratory Medical Center, Chaozhou Central Hospital, Guangdong, Chaozhou 521021, China; 3.Department of Neurosurgery, Chaozhou Central Hospital, Guangdong, Chaozhou 521021, China)

Objective To study adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) whether malignant transformation in vitro. Methods ADSCs were isolated and cultured from adipose tissues of mice, which were observed whether to occur malignant transformation. The tissue-specific markers of transformed cells were detected by immunocytochemistry, and the chromosome structure were analyzed. The transformed cells were transplanted into nude mice to investigate their tumorigenicity. Results A flask of ADSCs were successively cultured for 4 months and a number of cells had transformed and immortalized in vitro. The ADSCs were cultured more than 100 generations and still maintained the original cell proliferation rate. The marker of vimentin, PCNA, Ki67 and VEGF-c were expressed but the pan-CK and p16 were not expressed, which showed the cells were mesenchymal origin. Meanwhile, the chromosome analysis showed all cells were aneuploidy and translocation were very common. Microvilli structure of cell surface could be observed by transmission electron microscopy. There was no clone formation ability of transformed ADSCs in soft agar media. Nude mice subcutaneously transplanted could form tumor tissue that the main component was sarcoma. Conclusion Adipose tissuederived stem cells could malignantly transformed spontaneously in vitro, and which also could form tumors in nude mice after transplantation.

Sarcoma; Adipose tissue-derived stem cells; Malignant transformation; Stem cells; Immortalization

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.30672359）

1.廣東省潮州市中心醫(yī)院口腔科，廣東，潮州521021 2.潮州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東，潮州521021 3.潮州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東，潮州521021

★通訊作者：楊立業(yè)，E-mail:yangleeyee@sina.com