成彩聯(lián) 鄭振達(dá) 石成鋼 葉增純 李燦明 婁探奇★

2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科，廣東，廣州 510630

足細(xì)胞是附著在腎小球基底膜外側(cè)高度分化的細(xì)胞，足細(xì)胞和足突間的裂孔隔膜是構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)膜的最后一道屏障，多種重要的足細(xì)胞相關(guān)蛋白異常與蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)。晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGEs）是高糖環(huán)境下的重要產(chǎn)物，參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。Mundel等[1,2]認(rèn)為足細(xì)胞的細(xì)胞骨架破壞可引起足突融合，導(dǎo)致裂孔隔膜結(jié)構(gòu)消失，并破壞濾過(guò)膜的完整性，出現(xiàn)蛋白尿。本研究旨在觀(guān)察AGEs對(duì)足細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白α-actinin-4的影響，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

本研究采用的小鼠原代培養(yǎng)足細(xì)胞株MPC5由中山大學(xué)余學(xué)清教授惠贈(zèng)。選用德國(guó) Merck的AGEs，美國(guó)MP Biomedicals的細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），美國(guó) Proteintech Group的兔抗大鼠3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體，美國(guó)Sigma-Aldrich的兔抗α-actinin-4多克隆抗體、小鼠γ–干擾素、氯沙坦（Losartan）和結(jié)晶紫，美國(guó)Invitrogen的Rhodamine鬼筆環(huán)肽，美國(guó)Jackson ImmunoResearch的DyLight 488山羊抗小鼠IgG，以及德國(guó)META ZEISS的激光共聚焦顯微鏡LSM510。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

在33℃培養(yǎng)箱里，把足細(xì)胞放入含10 U/mLγ–干擾素（美國(guó)Sigma）10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)至不含γ–干擾素的10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃分化10～14天，取分化成熟的足細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為不同濃 度 的 AGEs組（0，20，40，80 μg/mL）和 BSA 組，用Western blot及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)α-actinin-4和F-actin，經(jīng)氯沙坦預(yù)處理后，觀(guān)察α-actinin-4和F-actin的改變。

1.3 Western blot

按說(shuō)明書(shū)提取蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，兔抗鼠α-actinin-4（1︰200），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（1︰60000）室溫孵育1 h，TBST洗3次，顯影、定影。用BioRad掃描儀掃描膠片，應(yīng)用Quantity One圖像分析軟件對(duì)特異性條帶進(jìn)行灰度掃描，以目的蛋白條帶與GAPDH 蛋白條帶灰度值的比表示其相對(duì)含量。

1.4 免疫熒光共聚焦檢測(cè)

將0.1% 明膠溶液包被蓋玻片放入六孔板中，加入等量消化好的細(xì)胞懸液，待其貼壁生長(zhǎng)至70%左右，同步化過(guò)夜，加處理因素培養(yǎng)24 h，依次經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.25% Triton X-100打孔，封閉，孵育一抗α-actinin-4（1︰100）和 Rhodamine鬼筆環(huán)肽，孵育DyLight 488山羊抗小鼠IgG（1︰1000），Hoechst 33342染核，滴少量抗熒光淬滅劑，指甲油封邊，激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果并掃描采集圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA方法，兩兩比較采用LSD方法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度AGEs對(duì)足細(xì)胞α-actinin-4的影響

不 同 濃 度 的 AGEs（0，20，40，80μg/mL）干預(yù)小鼠的足細(xì)胞24 h后，用western blot法檢測(cè)α-actinin-4的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，AGEs（80μg/mL）能明顯下調(diào)足細(xì)胞α-actinin-4的表達(dá)（P＜0.05），而B(niǎo)SA對(duì)α-actinin-4的蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯影響（P＞0.05），見(jiàn)圖 1、表 1。

圖1 不同濃度AGEs對(duì)足細(xì)胞α-actinin-4的影響Figure 1 Effects of advanced glycation end products on α-actinin-4 expression in podocytes

表1 AGEs對(duì)足細(xì)胞α-actinin-4表達(dá)的影響Table 1 Effect onα-actinin-4 expression with different concentration of advanced glycation end products in podocytes

2.2 氯沙坦對(duì)AGEs介導(dǎo)α-actinin-4的影響

小鼠足細(xì)胞經(jīng)氯沙坦（100μmol/L）預(yù)孵育60 min后，加入AGEs（80μg/mL）作用24 h，結(jié)果顯示：AGEs能明顯下調(diào)α-actinin-4的表達(dá)（P＜0.05），氯沙坦預(yù)處理能明顯減輕AGEs介導(dǎo)的α-actinin-4的下調(diào)程度（P＜0.05），見(jiàn)圖 2、表 2。

圖2 氯沙坦對(duì)AGEs介導(dǎo)α-actinin-4的影響Figure 2 Effects of losartan on α-actinin-4 expression induced by advanced glycation end products in podocytes

表2 氯沙坦減輕AGEs介導(dǎo)的足細(xì)胞α-actinin-4的下調(diào)Table 2 Losartan alleviated the downregulation of α-actinin-4 induced by advanced glycation end products in podocytes

2.3 氯沙坦對(duì)AGEs介導(dǎo)的足細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)的影響

小鼠足細(xì)胞經(jīng)氯沙坦（100μmol/L）預(yù)孵育60 min后，加入 AGEs（80 μg/mL）作用 24 h，激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示：AGEs引起α-actinin-4從膜周向胞核、核周遷移，F(xiàn)-actin從有序的平行狀纖維束重構(gòu)為雜亂無(wú)序的網(wǎng)狀物；氯沙坦預(yù)處理能減輕AGEs介導(dǎo)的的α-actinin-4的重分布，減少F-actin的重構(gòu)，見(jiàn)圖 3。

圖3 AGEs對(duì)足細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)的影響（×630）Figure 3 Effects of advanced glycation end products on cytoskeleton reorganization (×630)

3 討論

足細(xì)胞損傷在糖尿病腎病的發(fā)病中起著重要的作用，AGEs可直接作用于腎小球的足細(xì)胞，導(dǎo)致足細(xì)胞的凋亡、脫落。足突細(xì)胞骨架主要由F-actin組成，synaptopodin和α-actinin-4將F-actin連接在一起。足突的任何一個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)生功能障礙，都將引起肌動(dòng)蛋白從并聯(lián)的收縮蛋白束變成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并伴有足突融合和蛋白尿。有研究發(fā)現(xiàn)用白藜蘆醇穩(wěn)定足細(xì)胞骨架蛋白α-actinin-4的表達(dá)，可阻止TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞的凋亡[3]。因此闡明足細(xì)胞骨架重構(gòu)的機(jī)制對(duì)于足細(xì)胞的防護(hù)具有重要的意義。

α-actinin-4是一種肌動(dòng)蛋白微絲交聯(lián)蛋白，能將松散的肌動(dòng)蛋白纖維捆扎成具有收縮作用的纖維束，具有調(diào)節(jié)足突機(jī)械動(dòng)力的作用。α-actinin-4同時(shí)和大量的細(xì)胞骨架、細(xì)胞表面及信號(hào)傳導(dǎo)分子相互作用。α-actinin-4在胞內(nèi)一方面與基底膜的整合素復(fù)合物相作用，另一方面又能與裂孔隔膜復(fù)合物相連，從而將足細(xì)胞的兩個(gè)部分連接在一起，提示α-actinin-4在上皮細(xì)胞足突末端的肌動(dòng)蛋白微絲與整合素的錨定中起重要作用。

本研究通過(guò)以不同濃度的AGEs干預(yù)小鼠足細(xì)胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80 μg/mL AGEs能明顯下調(diào)α-actinin-4的表達(dá)，并使α-actinin-4從膜周向胞漿內(nèi)、核周遷移，足細(xì)胞F-actin肌動(dòng)蛋白由平行排列的纖維束變?yōu)殡s亂無(wú)序的網(wǎng)狀物。α-actinin-4的減少和F-actin的重構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞從穩(wěn)定表型轉(zhuǎn)變?yōu)檫w移表型，細(xì)胞的遷移性增加，導(dǎo)致骨架蛋白的高轉(zhuǎn)運(yùn)，消耗能量，終使足細(xì)胞脫落。有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病腎組織α-actinin-4表達(dá)下降與蛋白尿和腎小球病變密切相關(guān)，α-actinin-4的改變會(huì)導(dǎo)致濾過(guò)屏障破壞、足突的消失和蛋白尿，并逐漸出現(xiàn)腎小球硬化、腎衰竭和動(dòng)物死亡，而且異常表達(dá)的α-actinin-4與肌動(dòng)蛋白纖維絲的結(jié)合力增強(qiáng)形成聚合體，變得不穩(wěn)定且容易被蛋白酶降解，并促進(jìn)足細(xì)胞的凋亡[4～5]。Dandapani等[6]發(fā)現(xiàn)先天α-actinin-4缺乏小鼠與野生鼠相比，每個(gè)腎小球足細(xì)胞的數(shù)量減少，整合素磷酸化減少，而且在壓力不斷增加的情況下，足細(xì)胞黏附于基底膜的能力下降，提示肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架可通過(guò)影響足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或功能，參與蛋白尿的發(fā)生和發(fā)展。這些研究結(jié)果提示α-actinin-4的減少與足細(xì)胞的損傷、蛋白尿的發(fā)生、腎小球的硬化均有密切關(guān)系。

足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架處于動(dòng)態(tài)變化中，早期足細(xì)胞的形態(tài)改變，如足突融合、裂孔隔膜斷裂是可逆的，持續(xù)性損傷將導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡或從基底膜上脫落，最終進(jìn)展為腎小球硬化和終末期腎衰竭。如果能在一定時(shí)間內(nèi)去除損傷因素，則重構(gòu)的骨架蛋白會(huì)恢復(fù)，足細(xì)胞的功能改善。因此，研究細(xì)胞骨架重構(gòu)的調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于足細(xì)胞的防護(hù)具有重大的意義。Mifsud等[7]研究發(fā)現(xiàn)纈沙坦可減輕鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎小球基底膜裂孔隔膜的單位長(zhǎng)度，保護(hù)了足突的結(jié)構(gòu)。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑雖然廣泛應(yīng)用于腎臟疾病的治療，但對(duì)足細(xì)胞骨架蛋白的影響研究不多。因此，觀(guān)察其對(duì)足細(xì)胞在腎小球疾病過(guò)程中的病變作用及其機(jī)制的深入了解，必將為腎小球硬化的防治研究開(kāi)辟?gòu)V闊的前景。我們觀(guān)察了血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑氯沙坦對(duì)AGEs介導(dǎo)足細(xì)胞骨架蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯沙坦預(yù)處理足細(xì)胞后，AGEs介導(dǎo)的α-actinin-4的下調(diào)程度明顯減輕，α-actinin-4的重分布減少，F(xiàn)-actin重新恢復(fù)為平行排列狀。有研究[8]發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ通過(guò)氧化應(yīng)激激活rac1和ezrin/radixin/moesin（ERM）通路促使肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)。這些結(jié)果提示足細(xì)胞內(nèi)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活可能參與了AGEs介導(dǎo)的足細(xì)胞骨架蛋白的重構(gòu)和遷移性，減輕AGEs對(duì)足細(xì)胞骨架的影響可能是氯沙坦減少蛋白尿的另一作用機(jī)制。

綜上所述，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AGEs可以下調(diào)α-actinin-4的表達(dá)并介導(dǎo)骨架蛋白的重構(gòu)，而氯沙坦預(yù)處理可減輕AGEs介導(dǎo)的足細(xì)胞的這些損傷性變化。足細(xì)胞組成腎小球?yàn)V過(guò)膜的最后一道屏障，其損傷不但導(dǎo)致蛋白尿的出現(xiàn)，而且是腎小球硬化的核心環(huán)節(jié)。闡明足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，對(duì)于尋求更為有效的治療方法，阻止腎小球疾病的慢性進(jìn)展，進(jìn)而改善慢性腎臟病患者的生存質(zhì)量有重大意義。

[1] Asanuma K, Mundel P. The role of podocytes in glomerular pathobiology[J]. Clin Exp Nephrol, 2003, 7(4): 255-259.

[2] Weins A, Kenlan P, Herbert S, et al. Mutational and biological analysis of alpha-actinin-4 in focal segmental glomerulosclerosis[J]. J Am Soc Nephrol, 2005, 16(12):3694-3701.

[3] 楊汝春, 朱曉玲, 張華琴, 等. 白藜蘆醇對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡及骨架分子損害的干預(yù)作用[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志, 2013, 14(1): 9-14.

[4] Kimura M, Toyoda M, Kato M, et al. Expression of alphaactinin-4 in human diabetic nephropathy[J]. Intern Med,2008, 47(12): 1099-1106.

[5] Cybulsky A V, Takano T, Papillon J, et al. Glomerular epithelial cell injury associated with mutant alpha-actinin-4[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2009, 297(4): F987- F995.

[6] Dandapani S V, Sugimoto H, Matthews B D, et al. Alphaactinin-4 is required for normal podocyte adhesion[J]. J Biol Chem, 2007, 282(1): 467-477.

[7] Mifsud S A, Allen T J, Bertram J F, et al. Podocyte foot process broadening in experimental diabetic nephropathy:amelioration with renin-angiotensin blockade[J].Diabetologia, 2001, 44(7): 878-882.

[8] Hsu H H, Hoffmann S, Endlich N, et al. Mechanisms of angiotensin II signaling on cytoskeleton of podocytes[J]. J Mol Med (Berl), 2008, 86(12): 1379-1394.