董貞君，劉 洋，汪 蘋

（北京工商大學 食品學院 ，北京100037）

1 引言

氮雜環(huán)化合物廣泛存在于焦化、醫(yī)藥、染料、食品加工和農(nóng)藥等工業(yè)廢水中，在焦化廢水中占40%左右，而且大都是有毒且難降解的有機物，不易受代謝過程的破壞，對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康會產(chǎn)生潛在的長期危害[1～4]。吡啶是目前氮雜環(huán)化合物中開發(fā)與應用范圍最廣的化合物之一，是重要的工業(yè)原料，對神經(jīng)有致毒作用，水溶性和擴散性好。由于其毒性大，具有致畸、致癌和難生物降解等特點，致使傳統(tǒng)生物處理方法對其降解效果不佳[5]，因此篩選高效穩(wěn)定的專屬降解菌成為國內(nèi)外研究的熱點[6～9]。

本研究從處理嗎啉廢水的成熟活性污泥中分離得到了一株吡啶降解菌，對其進行性能測試和菌株鑒定，并選用四因素三水平L9（34）正交試驗對其進行培養(yǎng)條件優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)條件，為含吡啶廢水的生物強化處理提供了新菌株材料及其基本特性參數(shù)。

2 材料與方法

2.1 菌源

從處理嗎啉廢水SBR反應器（進水COD濃度2466mg/L，TN 為435mg/L，COD和 TN 去除率分別穩(wěn)定于90.12%和76.41%左右）里馴化成熟的活性污泥中篩選出的能以吡啶為唯一碳源、氮源的4株優(yōu)勢菌種。

2.2 培養(yǎng)基

（1）富集培養(yǎng)基：（NH4）SO4，0.47g/L；KH2PO4，1g/L；FeCl2·4H2O，1.058g/L；CaCl2，0.094g/L；MgSO4，0.489g/L；檸檬酸三鈉，5.1g/L；pH值7.0～7.5。

（2）液 體 測 試 培 養(yǎng) 基：KH2PO4，2g；MgSO4·7H2O，0.04g；FeCl3.6H2O，0.004g；10mL相應濃度的吡啶儲備液定容至1000mL，調(diào)pH值至7.0，121℃高溫滅菌20min，待放涼加入10mL濃度為2000mg/L（3000mg/L）的吡啶儲備液，此時培養(yǎng)基濃度為20mg/L（30mg/L）。

（3）吡啶儲備液：移取2.00g（3.00g）相對密度為0.98（20℃）的吡啶至1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容。此時吡啶儲備液的濃度為2000mg/L（3000mg/L）。

2.3 吡啶降解菌株的富集馴化

取250mL錐形瓶，在無菌操作條件下將實驗室已分離出的4株以吡啶為唯一碳源、氮源的優(yōu)勢菌種以10%的接種量接種于150mL吡啶濃度為20mg/L的液體測試培養(yǎng)基中，于30℃ 、180r/min下好氧振蕩培養(yǎng)120h，每隔24h測定菌株OD600，確定菌株生長曲線。本周期馴化結(jié)束后，將測試培養(yǎng)基中的菌株按10%的接種量接種到富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h進行富集，再進行新一周期的馴化，持續(xù)數(shù)周期。然后將底物濃度提高到30mg/L，篩選出適應性較強的菌株繼續(xù)馴化，通過篩菌過程中對菌株生長曲線的觀察以及對吡啶分解利用情況的監(jiān)測，挑選耐受能力和降解能力最高的菌株作為下一步實驗的優(yōu)勢降解菌。

2.4 菌株鑒定

2.4.1 形態(tài)及生理生化鑒定

菌株形態(tài)觀察和生理生化特征實驗包括接觸酶實驗、液化明膠實驗、淀粉水解、葡萄糖發(fā)酵實驗、吲哚試驗、乙醇氧化實驗、脲酶實驗、甲基紅實驗、V－P實驗、溫度、pH值實驗，操作步驟參照文獻[10]。

2.4.2 16SrDNA基因片段分離與序列分析

以TIANGEN基因組DNA提取試劑盒提取的細菌基因組DNA作為PCR反應模板，16Sr DNA序列分析 采 用 通 用 引 物[11]：正 向 引 物 為 27f （5＇－AGAGTTTGATCATGGCTCAG－3＇）；反 向 引 物 為1492r（5＇－TACGGTTACCTTGTTACGACTT－3＇）。PCR反應體系為模板DNA加2.5μL，上下引物各2.5 μL，PCR MasterMix2.5μL，加超純水至50μL。PCR反應程序：94℃預變性4min，然后94℃變性30s，52℃退火80s，72℃延伸90s，30個循環(huán)。最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下最后延伸8min，使反應產(chǎn)物擴增充分。委托三博遠志生物科技有限公司對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果在Gen Bank數(shù)據(jù)庫中已知細菌的16S rRNA序列進行相似度分析，并以Neighbor－Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[12，13]。

2.5 正交實驗優(yōu)化菌株吡啶降解性能的方法

在微生物降解過程中，其反應速率限制因素可能包括碳源、DO、pH 值、C/N和溫度等。李長征等[14]認為影響吡啶降解效果的主要環(huán)境因素包括溫度、搖床轉(zhuǎn)速、菌 種 投 加 量 等。 孫 慶 華 等[15]利 用 Shinella Zoogloeoides BC026菌進行吡啶降解實驗中指出，初始濃度是影響吡啶降解速率的重要因素。綜合考慮前人的研究成果本文選用四因素三水平L9（34）正交表設計實驗，L9（34）因素水平表及正交實驗結(jié)果分別見表1和表3，菌株在各條件下培養(yǎng)96h后測吡啶去除率。

表1 L9（34）因素水平

2.6 分析方法

菌體生長吸光度（OD600）：采用吸光度法，用721可見分光光度計在光密度為600nm處測吸光度值；

CODcr：采用美國HACH快速測定儀；

pH值：采用9157BN型Thermo Orion pH計。

吡啶濃度以固相微萃取—頂空氣相色譜法測定，儀器型號為VARIAN CP－3800氣相色譜儀，色譜柱為WARIAN CP－Wax 58（FFAP）CB極性（酸性）色譜柱。分流比10∶1，升溫程序∶初始溫度40℃，保持2min（升溫速率40℃/min）至140℃，保持5min。檢測器采取氫火焰 （FID）檢測器，檢測器溫度280℃，氣化溫度200℃，各氣流速：載氣N2為2mL/min，H2為40mL/min，空氣為350mL/min。

水樣預處理及固相微萃取方法：從液體測試培養(yǎng)基中取15mL水樣于離心管中，12000r/min高速離心10min，將上清液傾出，用0.22μm的水系濾膜過濾，取清液5mL，置于15mL頂空瓶中，加入1.5g氯化鈉，立即用聚四氟乙烯墊和帽密封頂空瓶，輕輕搖勻，待氯化鈉溶解后放入水浴溫度為58℃水浴中，插入固相微萃取頭，插入深度為2.5cm，萃取40min后取出針頭進樣進行色譜分析，解析5min，每兩次萃取過程之間將萃取頭在250℃下烘烤12min以去除殘留。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株的馴化與篩選

4株吡啶降解菌經(jīng)過不同吡啶濃度的液體培養(yǎng)基馴化后，篩選出1株降解能力最強且能以吡啶為唯一碳源、氮源和能源的菌株，命名為PY6，將PY6按10%的接種量接種到初始濃度為30mg/L的液體測試培養(yǎng)基中，30℃ 、180r/min的條件下好氧振蕩培養(yǎng)，經(jīng)過96h后對吡啶的降解率達到84.12%，可作為下一步實驗的優(yōu)勢降解菌。

3.2 PY6的初步鑒定結(jié)果

3.2.1 菌株的形態(tài)及生理生化特征

菌株P(guān)Y6在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d后觀察，菌株特征為淡黃色、濕潤、不透明、隆起、表面光滑、邊緣整齊。初步鑒定結(jié)果為革蘭氏陰性，桿狀菌（革蘭氏染色后菌株P(guān)Y6的顯微照片見圖1）。

菌株生理生化試驗結(jié)果見表2，從結(jié)果可以看出該菌株具有接觸酶、明膠酶、淀粉酶，在糖代謝過程可將葡萄糖分解為酸性物，分解蛋白胨中的色氨酸，可生成吲哚，可氧化乙醇。

表2 PY6的生理生化特征

3.2.2 菌株的分子生物學鑒定結(jié)果

對提取的菌株模板DNA進行PCR擴增，電泳圖結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出約1500bp處出現(xiàn)熒光條帶，且無明顯拖尾現(xiàn)象，陰性對照無條帶，說明反應體系沒有被污染。因此，PCR擴增產(chǎn)物能夠滿足后續(xù)測序的要求，利用Blast軟件在Gen Bank數(shù)據(jù)庫中進行序列相似性搜索。結(jié)合菌株的形態(tài)觀察、生理生化以及16S rDNA分子生物學鑒定，初步判斷菌株P(guān)Y6為假單胞菌。

圖1 菌株WXZ－2革蘭氏染色后顯微鏡形態(tài)觀察（×1000）

3.3 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

由表3對正交實驗結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)9組正交實驗中有5組實驗吡啶去除率均達到了70%以上，可見該菌株的環(huán)境適應性良好，同時以吡啶去除率為指標，計算不同因素下各個水平的去除率，以及反映各因素對指標影響大小的極差R。由表3極差分析可以判斷出各因素影響的主次順序為：振蕩速度＞初始濃度＞溫度＞pH值，振蕩速度是影響去除率的主要因素，轉(zhuǎn)速太低使溶解氧濃度偏低，轉(zhuǎn)速太高菌株會因離心力集中成團，減少與吡啶反應的機率；由K（均值）可以看出，對應理論最優(yōu)條件為：溫度＝25℃，pH值＝6.5，吡啶初始濃度＝40mg/L，搖床轉(zhuǎn)速＝160r/min；而表觀最優(yōu)條件為實驗組2：溫度＝25℃，pH值＝7.5，吡啶初始濃度＝40mg/L，搖床轉(zhuǎn)速＝160r/min。

圖2 16SrDNA擴增產(chǎn)物電泳圖

表3 L9（34）正交試驗方案及結(jié)果分析

由于表觀最優(yōu)條件不同于理論最優(yōu)條件，以表觀最優(yōu)條件作為培養(yǎng)條件，對其進行驗證實驗，結(jié)果理論最優(yōu)條件下吡啶去除率為90.59%，這與表觀最優(yōu)條件結(jié)果基本一致，而兩個最優(yōu)條件只有pH值不同，說明pH值對該菌株影響不大，這也與極差分析的結(jié)論pH值的影響最弱一致。pH值是廢水處理中不易控制的因素，但是所有因素中pH值的影響最小，證明PY6具有潛在的工程推廣應用價值。

3.4 降解性能跟蹤實驗

為了準確描述該菌株對吡啶的降解性能，在吡啶去除率最優(yōu)的條件即表觀最優(yōu)條件下，對OD600和吡啶濃度進行跟蹤測定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 優(yōu)選條件下PY6菌各參數(shù)隨時間變化曲線

由圖3可見，隨著菌密度增長，吡啶濃度逐漸降低。前24h菌株生長不明顯，所以吡啶濃度的降低主要是由于菌株的吸附作用。隨后的24h，由于PY6菌暫時處于適應期，菌株密度增長較慢，吡啶濃度的衰減速率也緩慢。在48h后菌株開始適應環(huán)境，進入對數(shù)生長期，吡啶降解速度加快，在96h，菌密度最大，吡啶去除率達91.2%，隨后菌密度下降。有報道[15]認為，由于吡啶的碳氮比為4.3∶1，此時微生物的死亡可能與缺乏碳有關(guān)。

4 結(jié)語

（1）從處理嗎啉廢水的成熟活性污泥中分離出1株能以吡啶為唯一的碳源、氮源的高效降解菌，該菌株為革蘭氏陰性菌，經(jīng)16SrDNA序列同源性分析以及部分生理生化反應初步鑒定PY6為假單胞菌。

（2）通過四因素三水平L9（34）正交實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌的環(huán)境適應性良好。吡啶初始濃度40mg/L、25℃、搖床轉(zhuǎn)速160r/min、pH值為7.5時吡啶去除率達91.64%，因而PY6為1株高效吡啶降解菌。

（3）在吡啶去除率最優(yōu)的條件下，通過跟蹤測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PY6菌生長狀況良好，吡啶的快速去除過程與菌體的生長過程基本一致，在48h后菌株開始適應環(huán)境，進入對數(shù)生長期，在96h菌密度最大，吡啶去除率達90%以上。

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