李思聰，曾富強(qiáng)，聶 健，王 斌，李金良，李旭廷

（四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所，四川 成都 610066）

在我國養(yǎng)殖業(yè)中，抗生素一直是防治畜禽細(xì)菌性感染疾病的首選，抗生素的長期使用雖然在防治細(xì)菌性疾病中起了重要作用，但是所帶來的藥物殘留及耐藥性等危害已日趨嚴(yán)重，給當(dāng)今規(guī)模化安全養(yǎng)殖和人類健康帶來了嚴(yán)重威脅。中藥屬于純天然藥物，其毒性低，不會造成嚴(yán)重的藥物殘留，不易產(chǎn)生耐藥性；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)利用中草藥及其提取物可以發(fā)揮直接殺滅病原菌或通過提高機(jī)體免疫力達(dá)到防治疾病的效果，這為我國傳統(tǒng)中藥替代抗生素防治細(xì)菌性疾病奠定了良好的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)選用連翹等7味中藥，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離耐藥株進(jìn)行了體外抑菌作用研究，旨在篩選出對臨床耐藥菌株有抑菌作用的藥物，為指導(dǎo)中藥在臨床上的正確使用，逆轉(zhuǎn)臨床耐藥菌株的耐藥性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥 赤芍、白術(shù)、穿心蓮、莪術(shù)、秦艽、連翹、知母，購自成都市德仁堂中藥店，經(jīng)四川某動(dòng)物藥業(yè)有限責(zé)任公司中藥檢驗(yàn)室的顯微鏡檢和薄層色譜鑒定，表明均為合格品。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922；臨床分離菌株：耐藥金黃色葡萄球菌LQ1007SA-5（分離自成都地區(qū)奶牛乳房炎病例），耐藥大腸埃希菌AY1106EC-2（分離自安岳縣仔豬臨床腹瀉病例），于四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所保存。

1.1.3 儀器與試劑 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52（上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)），高壓滅菌釜MLS-3750（產(chǎn)自日本三洋公司），凈化工作臺（成都紅光空調(diào)凈化設(shè)備制造公司生產(chǎn)），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)），游標(biāo)卡尺，微量移液器（芬蘭Finnpipette公司生產(chǎn)），玻璃涂布棒；N-甲基吡咯烷酮（NMP），營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)），慶大霉素藥敏紙片（10μg/片）、青霉素 G 藥敏紙片（10μg/片），均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥液的制備 取粉碎后的中草藥100g于1000mL 65%乙醇水溶液中，室溫浸泡30min后煎煮1h，稍加冷卻后過濾得到初煎液；在剩余藥渣中加入800mL 65%乙醇，煮沸1h，合并兩次煎液，減壓蒸餾濃縮至100mL，即制得提取物。提取物經(jīng)10000r/min離心5min，取上清液灌裝于5mL抗生素專用玻璃瓶中，即得1g/mL中藥上清液；于沉淀中加入等量NMP溶解，就可制成1g/mL中藥沉淀溶液，然后灌裝于5mL抗生素專用玻璃瓶中。將上清液和沉淀溶液分別在121℃下滅菌25min，于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備 將大腸埃希菌ATCC25922等2株標(biāo)準(zhǔn)株和大腸埃希菌AY1106EC-2等2株臨床分離株在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)后，又挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)12～16h，作為原菌液。

1.2.3 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備 將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂傾注至無菌干燥平皿上（約20mL），待培養(yǎng)基冷卻后將其置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行24h無菌檢測，用密封口袋封裝于4℃冰箱中備用，7d內(nèi)用完。

1.2.4 抑菌試驗(yàn) 采用管碟法。用微量移液器吸取濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏募?xì)菌稀釋液（1.5×108cfu/mL）100 μ至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，立即用無菌玻璃涂布棒均勻涂布，然后用無菌鑷子將鋼管均勻擺放在平板上，靜置10～15min，滴加受試藥液至液面與鋼管表面平行。將平板置于37℃下培養(yǎng)12～18h后，采用“十字交叉法”測定抑菌圈大小。

1.2.5 抑菌圈結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥藥理學(xué)》抑菌圈結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥20mm為高度敏感，10 19mm為中度敏感，＜10mm為不敏感。

2 結(jié)果

2.1 7種中藥提取物對大腸埃希菌的抑菌效果 由表1可知，在大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑菌試驗(yàn)中，7味中藥提取物沉淀部分的抑菌效果與慶大霉素相當(dāng)，抑菌圈直徑在19.86～22.84mm之間。在大腸埃希菌臨床株的抑菌試驗(yàn)中，連翹、赤芍、白術(shù)、知母沉淀部分的抑菌效果優(yōu)于慶大霉素，抑菌圈直徑在18.58～22.28mm之間。總體上看，受試7味中藥沉淀部分的抑菌效果較好，且均優(yōu)于各自上清液的抑菌效果。

表1 中藥提取物對大腸埃希菌的抑菌效果mm

2.2 7種中藥提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果 由表2可知，在金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑菌試驗(yàn)中，味中藥提取物的抑菌效果不如青霉素。在金黃色葡萄球菌臨床耐藥株的抑菌試驗(yàn)中，連翹、赤芍提取物的抑菌效果優(yōu)于青霉素，抑菌圈直徑在24.94～26.60mm之間總體上看，7味中藥提取物對臨床耐藥金葡菌的抑菌效果要好于標(biāo)準(zhǔn)金葡菌，且沉淀部分的抑菌效果要優(yōu)于各自的上清液。

表2 中藥提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果 mm

3 討論

3.1 不同提取條件對抗菌效果的影響 不同提取條件對中藥抗菌成分提取率的影響非常廣泛。應(yīng)用于中藥提取物生產(chǎn)的溶劑主要有水、乙醇及兩者的混合物，但中藥抗菌成分復(fù)雜，無論選用水提醇沉法還是醇提水沉法均會產(chǎn)生大量沉淀，被當(dāng)成無用物質(zhì)除去。本項(xiàng)研究選擇水醇混合溶劑進(jìn)行煎煮提取，最大限度地促進(jìn)中藥有效成分的溶出提取，在蒸發(fā)濃縮階段除收取上清液外，對濃縮過程產(chǎn)生的沉淀用無抗菌活性的N-甲基吡咯烷酮進(jìn)行復(fù)溶，同時(shí)測定上清液和沉淀物的抗菌效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，多數(shù)受試中藥提取后沉淀物的抗菌效果優(yōu)于上清液，可以推測出抗菌活性物質(zhì)應(yīng)多為極性小的醇溶性物質(zhì)，這為進(jìn)一步開展相關(guān)活性成分的分離鑒定起到了指示作用。

3.2 中藥提取物對耐藥菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效果 受試的臨床大腸埃希菌（AY1106EC-2）分離自四川仔豬腹瀉病例，與標(biāo)準(zhǔn)大腸埃希菌株相比，前者降低了對慶大霉素的敏感性。但在本次試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，連翹、赤芍白術(shù)、知母沉淀部分的抑菌效果優(yōu)于慶大霉素，并且與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，中藥對臨床菌的抑菌圈更大，顯示出中藥提取物的抑菌機(jī)制不受耐藥菌通常的耐藥機(jī)制影響受試的臨床耐藥金黃色葡萄球菌（LQ1007SA-5）分離自成都周邊奶牛場奶牛乳房炎病例，在前期耐藥性測試中表現(xiàn)出明顯的多重耐藥性，耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)其含有mecA基因，該基因負(fù)責(zé)編碼的青霉素結(jié)合蛋白2α能降低青霉素的結(jié)合，維持金葡菌細(xì)胞壁的正常功能，達(dá)到對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的效果。在受試的7種中藥中，多數(shù)表現(xiàn)出較好的抑菌效果，其中赤芍和連翹提取物對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果接近甚至優(yōu)于抗生素。特別是赤芍和連翹提取物的沉淀部分，對臨床耐藥金葡菌的抑菌效果顯著優(yōu)于青霉素但在標(biāo)準(zhǔn)金葡菌抑菌試驗(yàn)中，效果明顯不及青霉素這說明中藥對耐藥金葡菌的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)或許不同于β-內(nèi)酰胺類抗生素，有可能增加了抗菌活性物質(zhì)與耐藥金葡菌細(xì)胞壁靶蛋白的結(jié)合能力，進(jìn)而破壞金葡菌細(xì)胞壁的合成，增加其對中藥抑菌物質(zhì)的敏感性，達(dá)到提高抑菌效果的目的。其內(nèi)在作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

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